禽流感病毒的分离与鉴定研究

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一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒的分离鉴定

３７℃孵化４８ｈ后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝价，将具有血凝价的鸡胚尿囊液分别与ＮＤＶ、蛋综合征减
病毒、Ｈ５亚型禽流感病毒的标准阳性血清进行血凝
１材料与方法
１１材料．
抑制（）ＨＩ试验，体操作程序按照世界动物卫生组具织（Ｅ的标准方法进行，鉴定过的病毒分装，ＯＩ）将保存于一７Ｃ备用ｊ０。。１２２病毒特异性片段的ＰＲ扩增以及序列测定．．Ｃ
２５。００
关键词：流感病毒；Ｈ５禽Ｎ２亚型；定；鹉鉴鹦
中图分类号：８２６９５￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０００ — ０７０１０ — ０８２１）４０５ — ３
禽流感（ｉｎｉｆｅｚ，）是由Ａ型流感病ＡｖａｎｌｎａＡＩｕ
１２１病毒的分离及ＨＡ亚型鉴定将采集的鹦．．
鹉源拭子按照世界动物卫生组织的国际标准方法处理，种１日龄ＳＦ鸡胚尿囊腔，胚０１ｍＬ，接０Ｐ每．
型禽流感病毒暴发的报道ｌ，宿主源多数集中在３－而］
禽流感病毒流行情况的复杂化，内时有Ｈ５国Ｎ２亚
Ｈ５标准阳性血清由国家动物流感参考实验室提供；鸡新城疫病毒（Ｖ）ＮＤ及减蛋综合征病毒的标准阳性血清由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供。

朱鹮低致病性禽流感病毒的分离与鉴定

没有分离朱鹦流感病毒株的报道。为了解ＡＩ毒Ｖ
株在朱鹦体内的流行状况，试验首次在国内从朱本
１２４鸡胚ＭＤ和Ｌ的测定将所分离毒株．．ＴＤ。用无菌ＨａｋＳｎ液作１Ｏ倍递增稀释，１～ｌ取ＯＯ
表１分离的ＡＩ毒株ＩＰ观察结果ＶＣＩ
ＴａｌＩＩｒｓｌｓｏｓｌｔｄＡＩｂｅ１ＣＰｅｕｔｆｉｏａｅＶ
３讨论
的ＡＩ毒株与鸡的同种亚型ＡＩ毒株在基因组序ＶＶ
ＮＡ）的亚型还有待从病死朱鹦体内分离到１ＡＩ毒株，株Ｖ经鉴定列上的差异以及其神经氨酸酶（
和１稀释，ｏ倍每个稀释度分别以滴鼻点眼的方式接
种５只６龄ＳＦ鸡，只０２ｍＬ，周Ｐ每．连续观察１，０ｄ记录雏鸡发病和死亡情况。按Ｒｅｄｍｕｎｈ法计ｅ— ｅｃ算Ｌ０Ｄ５。１２５１日龄ＳＦ鸡ＩＰ．．ＰＣＩ的测定将所分离的ＡＩＶ毒株用无菌ＨａｋＳ做１：１ｎ液０稀释，脑内经接种２０只１日龄ＳＦ鸡，．５ｍＬ每只，养于隔Ｐ００／饲
Ｌ５Ｄｏ指数为５，Ｐ为１５４ＯＩＩＣ．４。以上结果表明所分离的病毒为低致病力禽流感毒株。
关键词：朱鹨；流感病毒；离鉴定禽分
中图分类号：８２６９５￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０１０ —０２０１０ —０８２１）２０４—３

禽流感病毒分离鉴定及其NA基因克隆分析

关键词：流感病毒Ｈ５；离；定；禽Ｎ１分鉴ＮＡ基因；ＨＡ基因
中图分类号：３；８２６９２Ｑ９９￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０００ —０６０１００８２１）４０１ —４
２００８年，我国南方某地多家养鸡场发生鸡群在
１２３微量血凝试验（．．ＨＡ）微量血凝抑制试验及
急性大批死亡，鸡鸡冠出『或发绀，部水肿，病ｆ【Ｌ头肌肉和其他组织器官广泛性严晕出血，其产蛋鸡尤群出现严重神经症状，歪向一侧。头站小稳，巢卵
（书医研究所础医学研究审，林Ｋ弁ＩＯ６）。０２３
摘要：疑似禽流感病死鸡病料组织研磨液接种ＳＦ鸡胚分离病毒。囊分离毒经电镜观察后，用将Ｐ尿应
特异性Ｒ — Ｃ方法和血凝及血凝抑制试验进行分型检测，时对核蛋白全长基因进行扩增测序分析通ＴＰＲ同
过血凝及血凝抑制试验初步证实分离的禽流感病毒为Ｈ５亚型，后对分离株ＨＡ基因和ＮＡ基因进行然Ｒ — Ｃ分析，定该分离株禽流感病毒为ＨＮ１亚型。通过ＮＡ全基因扩增测序、ｌｓ分析显示该分离ＴＰＲ确Ｂａｔ株ＮＡ基因序列与已发表的毒株基因序列（Ｕ２７７同源性为９，基因３端发生明显变异。Ｅ４９４）７但

禽流感病毒的分离技术和鉴定方法研究进展

当代医学
２０年２０９，９第１卷第４５期总第１９５期
ＣｎｅｏａｙＭｅｉｎ，Ｆｂ０９Ｖ１１Ｎ．Ｉｕｏ１９ｏｔｍｐｒｒｄｃｅｅ．２０，ｏ．５ｏ４ｓｅＮ．５ｉｓ
禽流感病毒的分离技术和鉴定方法研究进展
的差异。
ｃ之间的某个位置形成纯样品区带；ｍ或用Ｆｃｔ３％－４％Ｗ／ｉｏｌ０，０
Ｗ线性梯度，毒沉降在１１－１１ｇｃ之间；病．３．５／ｍ或用Ｐｒｏｌｅｃｌ作平
衡等密度离心，自形成梯度，毒悬液与Ｐｒｏｌ合，始密度病ｅｃｌ混初
到病毒形态。
甩平转头Ｐ８上海天美肯公司购自）Ｗ２贝克曼）２Ｓ（或Ｓ８（转头，
２，０ｒｍＸ３分钟，＂。０００ｐ０５Ｃ病毒在１０ｇｃ附近形成纯样品区．６／ｍ
作者单位：５６０贵州凯里市人民医院检验科（５００郭秀碧
病毒裂介和进一步对血凝素，神经氨酸酶，ＲＮＡ及其他蛋白
值，以导致动作电位复极时程延长。可这个结果与Ｔ使豚鼠心ＦＣ室肌动作电位的ＡＰＤ延长是相符合的。这样就可以得出结论ＴＦＣ
１分离纯化和观测采集气管粘液或泄殖腔粘液，或病变组织（吸道、呼消化
道）加纯水制作匀浆（０，１％悬液）低速冷冻离心机（，台式或立式均可），０－４００ｐ３００，０ｒｍ，４７ ℃，５２分，１～５１－０弃沉淀，即得到粗

孔雀低致病性禽流感病毒株的分离与鉴定

国和前苏联也有局部发生，现在几乎已遍布世界各地。禽流感病毒的感染谱很广，大多数的家禽、野禽及水
禽都可感染，以鸡、火鸡和某野禽最易感染，、鸭鹅及其他水禽类为隐性感染和带毒，有时也会大批死亡，并
造成严重的经济损失。１９年，９７香港暴发轰动全球的ＨＮ禽流感疫情，１５１有８人受感染，并造成６人死亡，引起生物学者的高度关注。我国自１９年以来在鸡、、、９３鸭鹅鸽等家禽中经血清学调查证实有Ａ阳性禽群Ｗ存在或已分离到Ａ型禽流感病毒。据报道，迄今为止，我国已分离的ＡＶ有Ｈ、５Ｈ、９和Ｈ４等亚型，Ｉ４Ｈ、７Ｈ１
摘要：用鸡胚分离方法从发病孔雀脑－ｇ￣分离病毒；￣ｑＨ将分离病毒进行血凝试验、血凝抑制试验、致病指数试
验和半数致死量试验。结果表明，该株病毒可凝集鸡红血球，血凝性可被已知的禽流感（ｇ２抗体所抑制，ＨＮ）脑内致病指数在１６．．２５范嗣内，半数致死量，病指数为５％，明该病毒为低致病力禽流感毒株。致０表关键词：低致病性禽流感病毒（ｏＩ）脑内致病指数（Ｐ）致病指数（１；ＬＡＶ；ＩＩ；Ｃ ⅣＰ）半数致死量（ｕｋ）
血清，由中国兽医研究所提供；３Ｐ实验室由农业部青岛动物检疫所提供使用。
１２方法．
１２１发病孔雀的症状及病理剖检．．
发病孔雀卧地不起，精神沉郁，爪子干瘪。剖检发现，呼吸系统和消化道呈现明显的病理变化，气管环有出血，肺脏严重出血、淤血，早现病理性实变；小肠各段均有不同程度的出血，胃、胃交界处有出血、肌腺溃疡

禽流感病毒的分离与鉴定技术

禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。

如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。

①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。

该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。

禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。

一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。

高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。

目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。

近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。

文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。

①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。

死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。

由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。

①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。

对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。

内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。

①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。

两株H6N8亚型禽流感病毒分离株的分离与鉴定

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆａｖｉａｎｉｎｌｆｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ（ＡＩＶ）ｉｎＳｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａ，ｔｗｏＡＩＶｓ（ＦＪ／１９１／１１ａｎｄＧＺ／０３５／１１）ｏｆＨ６Ｎ８ｓｕｂｔｙｐｅｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｌｉｖｅ－ｐｏｕｌｔｒｙｍａｒｋｅｔｓｄｕｒｉｎｇ２０１１．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｓｔｈａｔｂｏｔｈｉｓｏｌａｔｅｓ
序列测定，并进行其对ＳＰＦ鸡和ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的致病性试验。序列分析显示：ＨＡ裂解位点基序为３９ｐＱＩＥＴＲ
ＧＬＦＧ￣８，为低致病性ＡＩＶ特征。内部基因分别源于两个国内流行的Ｈ６亚型病毒家系（ＳＴ３３９．１ｉｋｅ和ＨＵＮ５７３．１ｉｋｅ）。序列分析表明ＦＪ／１９１／１１和ＧＺ／０３５／１１为Ｈ６亚型病毒与其他亚型ＡＩＶ的Ｎ８ＮＡ基因发生重组，呈
ｈａｄａＨＡｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｏｆ３９ｐＱＩＥＴＲＧＬＦＧ￣，ｗｈｉｃｈｉｓａｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｏｆｌｏｗｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓＡＷ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ

一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定

病毒，照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为Ａ／ｗａ／ａｇｏｇ１７２０。按ＳｎＧｕｎｄｎ／９／０４
关键词：流感；Ｈ５禽Ｎ１亚型；天鹅；离鉴定分
中图分类号：８２６９５￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０００ — ０５０１０ —０８２１）５００—４
动物医学进展。００３（）５８２１，１５：－
ＰｒｒｓｎＶｅｅｉａｙＭｅｃｎｅｏｇｅｓｉｔｒｎｒｄｉｉ
一
株天鹅源Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的分离鉴定
（南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室华广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，东广州５０４）广１６２
收稿日期：０９１－４２０ — １２基金项目：育部新世纪优秀人才支持计划项目（Ｅ－６０５）教育部创新团队项目（Ｔ７３；家肉鸡产业技术体教ＮＣＴ０ — ７２；Ｉｏ２）国Ｒ系项目（ｙｙｘ４－３０）广东省自然科学基金项目（４１６２１０１２；东省科技计划项目（Ｏ７ＯＯｏＯＩｎｃｔ－２Ｇ —３；８５０４００１３）广２ＯＡ２３Ｏ１）作者简介：煦灿（９３）男，东汕头人，士研究生，要从事动物病毒分子生物学及动物传染病防控研究。郑１８一，广硕主＊通讯作者：＃对本文有同等贡献作者

H1亚型禽流感病毒的分离鉴定

１材料与方法
１．１材料
１．１．１标准阳性血清抗Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ８、
流感大流行中均被证实是由Ｈ１亚型流感病毒或Ｈ３亚型流感病毒造成的。虽然目前没有证据能够充分证明这几次大流感的两种亚型病毒是来源于禽类，但可以推断出禽源的Ｈ１和Ｈ３亚型ＡＩＶ在为人类流感病毒的流行中提供了部分基因片段ｌ。
Ｈ１亚型禽流感病毒的分离鉴定
郭捷，谢芝勋，刘加波。，罗思思，庞耀珊，邓显文，谢志勤。，谢丽基。，范晴
（１。广西大学动物科学技术学院，广西南宁５３０００４；２．广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁５３０００１）
通过血凝试验（ＨＡ）、血凝抑制试验（ＨＩ）发现分离株只与Ｈ１亚型ＡＩＶ的血清反应，ＲＴ — ＰＣＲ鉴定其在４２２
ｂｐ处出现目的条带，进一步确定其为Ｈ１亚型ＡＩＶ。再根据鉴定后的毒株对鸡胚半数感染量（ＥＩＤ。）、鸡胚
半数致死量（ＥＩＤ。。）的测定与致病性试验，发现６株分离株均不会致ＳＰＦ鸡死亡，确定所分离的Ｈ１亚型
ＡＩＶ为低致病性禽流感病毒。关键词：Ｈｌ亚型禽流感病毒；分离；鉴定

MDCK细胞分离禽流感病毒

一、目的流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。

本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。

（二）材料1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3、HEPES缓冲液，1M母液4、D-MEM培养基，Hank's液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管（三）实验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入①青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）②牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）③HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。

2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。

①用40×物镜观察细胞生长状态。

②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。

（2）细胞培养瓶的接种①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。

②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。

③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。

④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。

然后加入6mL 病毒生长液于细胞培养瓶中。

⑤放置于33～35℃培养箱培养。

⑥每日观察细胞病变情况。

（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。

H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验

H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验许佳敏，边海霞（宁夏家禽工程技术研究中心银川750001）更好防控H9N2亚型禽流感，且做到科学免疫，免疫减负。

本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料，将其无菌处理后接种SPF 鸡胚后进行病毒分离，通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。

结果显示：分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒（AIV ）；血凝试验（HA ）效价在10～11，该病毒属于欧亚分支的BJ 亚分支。

将病毒纯化后，制备灭活疫苗免疫SPF 鸡，免疫后14d 对其进行HI 检测，结果显示其效价到达峰值为10Log2，免疫后28～35d 其平均效价在9.6Log2，至免疫后12周平均效价在7Log2。

结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果，可以作为疫苗候选株。

亚型禽流感毒株，免疫，疫苗禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza ，AI ）的简称，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae ）、流感病毒属（influenza virus ）、A 型流感病毒（influenza A virus ）引起的禽类疾病[1]。

国际兽医局（OIE ）将禽流感列为A 类动物疫病，我国也将其定为一类动物传染病。

H9N2禽流感病毒是低致病性亚型，在世界各地家禽群中流行。

目前，H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行，虽然死亡率低，但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常，产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋，鸡群产蛋率下降30%～80%，病程持续时间长的可达月余，造成严重的经济损失[2]。

该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快，不同血清型之间交叉保护有限；所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义[3]。

本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株，并进行动物试验，为进一步筛选疫苗提供理论依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源疑似发病鸡病料，采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。

一株三穗鸭源 H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定

一株三穗鸭源 H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定陈佳琪;嵇辛勤;段志强;文明;阮涌;李世静;雷云【摘要】探讨 H6N6亚型禽流感病毒在鸭群中的流行状况，为贵州省流感疫情动态监测及防控提供依据。

从贵州三穗县某养鸭殖场采集50份泄殖腔棉拭子，处理后经过绒毛尿囊腔接种9日龄非免疫鸡胚，通过血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）分离到1株既不是新城疫病毒，也不是 H5、H7和 H9亚型禽流感的病毒；提取病毒 RNA，通过禽流感病毒 HA 和 NA 基因通用引物扩增得到相应的 HA 和 NA 基因片段。

经过测序比对分析证实所分离病毒为 H6N6亚型禽流感病毒。

贵州鸭群中存在 H6N6亚型禽流感病毒，为进一步研究其起源和致病性提供了重要依据。

%The present study was aimed to explore the presence and spread ofH6N6 subtype influenza virus in birds in order to provide a basic dynamicof monitoring or prevention and control of avian influenza outbreaks in Guizhou.The 50 cloacal swabs were collected from duck farms in Sansui of Guizhou province,the virus was isolated and inoculated to 9 day chicken-embryos.By hemagglutinin (HA)and hemagglutination inhibition(HI)tests,the virus is neither a Newcastle disease virus,nor is H5,H7 and H9 subtypes of avian influenza virus.The viral RNA was extracted to amplifythe corresponding HA and NA gene fragments by universal primers of avian influenza vi-rus HA and NA genes.These results suggested that the strain was H6N6 avian influenza virus by comparison with other strains.This study proved that the H6N6 subtype influenza virus exists in ducks of Guizhou,it provides an important basis to further study its origins and pathogenicity.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)010【总页数】6页(P48-52,53)【关键词】H6亚型;禽流感病毒;分离;鉴定;鸭【作者】陈佳琪;嵇辛勤;段志强;文明;阮涌;李世静;雷云【作者单位】贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025; 贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025; 贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025; 贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025; 贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025; 贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5一株三穗鸭源H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定陈佳琪1，2，嵇辛勤1，2＊，段志强1，文明1，2，阮涌1，李世静1，2，雷云1，2（1．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2．贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳550025）摘要：探讨H6N6亚型禽流感病毒在鸭群中的流行状况，为贵州省流感疫情动态监测及防控提供依据。

禽流感病毒分离株HA基因的克隆及序列分析研究

禽流感病毒分离株HA基因的克隆及序列分析研究李晶;李治;刘华【期刊名称】《临床和实验医学杂志》【年(卷),期】2006(5)10【摘要】目的对禽流感病毒番鸭分离株进行HA 全基因克隆及序列分析比较,以了解其HA 基因的分子生物学性状及进化情况.方法提取及扩增分离株病毒RNA ,对其PCR 产物进行克隆及测序,对阳性重组质粒进行电泳鉴定及测序.结果番鸭流感病毒分离株与欧亚种系代表株及北美种系代表株作同源率比较分析,同源率低.与GD/96比较,基因亲缘关系极为密切,且具有相似的生物学特性.分离株HA 基因裂解位点的氨基酸序列符合AIV 强毒株HA 基因裂解位点的分子模式.结论该分离株的HA 基因裂解位点的氨基酸序列符合AIV 强毒株基因裂解位点的分子模式.本试验为H5 亚型HPAIV 和LPAIV 的分子生物学诊断和基因工程疫苗的研究奠定了基础.【总页数】2页(P1482-1483)【作者】李晶;李治;刘华【作者单位】襄樊市中心医院,肝病科,华中科技大学同济医学院附属襄樊医院,湖北,襄樊,441000;陕西师范大学生命科学学院,陕西,西安,710000;襄樊市中心医院,肝病科,华中科技大学同济医学院附属襄樊医院,湖北,襄樊,441000【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.三株鸡源H4亚型禽流感病毒分离株HA基因的序列分析 [J], 张鹏;黄娟;陈杰;蒋文明;陈继明;单虎2.鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A／Goose／XJYL／10／2003HA基因的克隆和序列测定与分析 [J], 崔尚金; 雷程红; 成进; 李曦; 符芳; 王靖飞; 吴春燕; 童光志; 孔宪刚3.鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A/Goose/XJYL/10/2003HA基因的克隆和序列测定与分析 [J], 崔尚金; 雷程红; 成进; 李曦; 符芳; 王靖飞; 吴春燕; 童光志; 孔宪刚4.禽流感病毒番鸭分离株HA基因的克隆及序列分析 [J], 谢静;王永坤;严维巍;庄国宏;周继宏;王建业;刘华雷;郁斌;朱国强5.禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析 [J], 唐志芬;贾永清;王君伟;孙进华;管雪婷;高宏丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

禽流感诊断研究进展

泻；产蛋量下降。有时疾病的暴发很迅速，在没有明显症状时就已发现鸡死亡。在高致病力病毒感染时，发病率和死亡率可达１％。但００有些病毒可引起一种禽类的严重疾病而对别种禽类却只引起不明显的
进展作一综述。
诊断禽流感主要依靠临床症状、病理解剖及实验室诊断。常用的实验室诊断方法有：病毒的分离鉴定，血清学诊断方法包括血凝及血凝抑制实验（ＡＨ）Ｈ，Ｉ、神经氨酸酶抑制实验（ＩＮＴ）、琼脂糖扩散实验（ＧＡＰ）、病毒中和实验（Ｔ）、酶联免疫吸附实验（ＬＳＮＥＩＡ）、免疫荧光技术（ｒ等；分子生物学诊断技术以及电镜技术等。Ｉ）Ｆ２０年我国通过国家质检总局鉴定，确认荧光Ｒ — Ｃ法作为国家检０４ＴＰＲ测禽流感新的标准。
免疫吸附试验（ＬＳ）点一ＬＳ研究的基础上，ＥＩＡ和斑ＥＩＡ建立了以杆状病毒系统表达的ＡＶＩ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断
出，将直接影响活禽及相关产品的对外贸易，并造成恶劣的国际影响。特别是高致病性禽流感（Ｐ１ＨＡ），是严重危害养禽业的烈性传染病，不仅对鸡群造成毁灭性打击，而且严重威胁到人类生命健康。据世卫组织公布的最新资料显示：０３２从２０年１月底在亚洲各国爆发的禽
流感至今年ｌ月，有１８Ｏ１人感染禽流感，其中６人死亡。禽流感在亚１洲肆虐之后，又蔓延至欧洲诸国。我国于２０年冬１多个省地相继发０５Ｏ生禽流感，并出现人类死亡病例“ 面对日益严峻的形势，多国纷纷推 ’ 。

一株肉仔鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定

深入开展炭疽杆菌分子生物学研究
Ｉ１１０
。
８７１肉鸡，早可发生于８最日龄，要表主现为突然减料，达１３１２饮水量可／ —／。下降，亡率较高，制不及时日死亡死控
气管、脏、脏等病料及血清采肺脾自聊城某发病肉鸡群：Ｐ鸡胚由梅里ＳＦ亚维通有限公司提供：验用８７仔实１肉鸡购自山东聊城莘县种鸡场：Ｄ、ＮＥＳ７标准阳性血清及标准抗原购Ｄ一６
５分子生物学研究近况炭疽杆菌是细菌学历史中发现和
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２。该分离的Ｈ亚型禽流感病毒的鸡胚致死时间均在６之内，所采集血清进９９０ｈ对
行Ｈｌ测，检结果显示，Ｉ体水平明显高于未发病鸡群。Ｌ０２株病毒液静脉注Ｈ抗将Ｃ６６
酪样物质，脏出血，脏潮红肿胀。肺肾
通过鸡胚接种分离到一株病毒，对其
进行鉴定和致病性试验。
１材料与：－ｂ法１１材料、剂．试
备过程中易降解，获取质粒难度大有
关。目前，国外已开展了炭疽杆菌分子水平的研究，有关报道不详。们成但我功地构建了ｐＯ１质粒基因文库和建Ｘ立了ＤＡ针检测方法．有助于国内Ｎ探

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

中国畜牧兽医 2024,51(4):1642-1650C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析韩慧1,郭亚晶1,颜广智2,陈盛楠2,刘明杰2,莫美连2,黄良宗1(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院,佛山528000;2.广东方道基因生物科技有限公司,佛山528000)摘要:ʌ目的ɔ了解广东地区猪流感病毒(S w i n e i n f l u e n z a v i r u s ,S I V )的流行情况并探究其分子生物学特征㊂ʌ方法ɔ采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定㊁遗传进化和关键氨基酸位点分析㊂ʌ结果ɔ样品经实时荧光定量R T -P C R 检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1ʒ128;8个基因片段序列结果经B L A S T 比对和进化树分析显示,HA ㊁N A 基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H 1N 1)分支,P A ㊁P B 1㊁P B 2㊁N P 和M 基因属p d m /09分支,N S 基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)㊂关键氨基酸位点分析显示,分离株HA 蛋白裂解位点序列为P S I Q S R /G L ,具有典型低致病性流感病毒的分子特征㊂HA 基因在受体结合位点处的190㊁225㊁226位氨基酸分别为D ㊁E ㊁Q ,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能㊂N A 基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M 基因3处氨基酸位点突变为V 27A ㊁A 30T ㊁D 44A ,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加㊂ʌ结论ɔ本研究分离鉴定的毒株为G 4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征㊂本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据㊂关键词:欧亚类禽猪流感病毒;分离鉴定;序列分析;H 1N 1亚型中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.032 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-11-17基金项目:广东省自然科学基金项目(2017A 030310612)联系方式:韩慧,E -m a i l :1570387219@q q .c o m ㊂通信作者黄良宗,E -m a i l :l i a n g z o n g h u a n g@f o s u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dG e n e t i cE v o l u t i o nA n a l ys i s o f a E u r a s i a nA v i a n -l i k e S w i n e I n f l u e n z aV i r u sH A N H u i 1,G U O Y a j i n g 1,Y A N G u a n g z h i 2,C H E NS h e n gn a n 2,L I U M i n g j i e 2,MO M e i l i a n 2,HU A N GL i a n g z o n g1(1.S c h o o l o f L i f eS c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g ,F o s h a nU n i v e r s i t y ,Fo s h a n 528000,C h i n a ;2.G u a n g d o n g F i n d e r g e n eB i o t e c h n o l o g y C o .,L t d .,F o s h a n 528000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e e x pe r i m e n tw a s a i m e d t ou n d e r s t a n d t h e p r e v a l e n c e of S w i n e i n f l u e n z a v i r u s (S I V )i n G u a ng d o n g a n de x p l o r e i t sm o l e c u l a rb i o l o g i c a l ch a r a c t e ri s t i c s .ʌM e t h o d ɔN a s a l s w a ba n dl u n g t i s s u es a m p l e so f p i g ss u s pe c t e dt ob e i nf e c t e d w i t hS w i n e i n f l u e n z av i r u sw e r e c o l l e c t e d f r o ma p ig f a r m i nG u a n g d o n g f o r v i r u s i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n ,g e n e t i c e v o l u t i o n a n d k e y a m i n o a c i d s i t e a n a l y s i s .ʌR e s u l t ɔTh e s a m pl e sw e r e t e s t e d p o s i t i v e f o rS w i n e i n f l u e n z av i r u s n u c l e i c a c i db y R e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P C R.I n t h e r e db l o o dc e l l a g gl u t i n a t i o n t e s t ,t h ev i r u s e x h i b i t e d a g g l u t i n a t i o nw i t h c h i c k e n r e db l o o d c e l l s ,w i t hah e m a g gl u t i n a t i o n t i t e r o f 1ʒ128.T h e r e s u l t s o f s e q u e n c i n g a n a l y s i so f e i g h t g e n es e g m e n t sw e r ea n a l y z e db y B L A S Tc o m pa r i s o na n d4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析c o n s t r u c t i o no fe v o l u t i o n a r y t r e e s,a nd HA a n d N A ge n e sb e l o n g e dt ot h eE u r a s i a na v i a n-l i k e S w i n e i nf l u e n z av i r u s(H1N1)b r a n c h,P A,P B1,P B2,N P a n d Mg e n e sb e l o n g e d t o th e p d m/09 b r a n c h,a n d N S g e n eb e l o n g e dt ot h e N o r t h A m e ri c a nt r i p l er e a s s o r t a n tb r a n c h,t h e r e f o r e,t h e i s o l a t e i n t h i s s t u d y b e l o n g e dt o t h eG4g e n o t y p eE u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n e i n f l u e n z av i r u s,a n d w a s n a m e dA/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1).K e y a m i n oa c i ds i t e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e c l e a v a g e s i t e s e q u e n c e o fH A p r o t e i no f t h e i s o l a t ew a sP S I Q S R/G L,w h i c hh a d t h em o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s o f a t y p i c a l l o w p a t h o g e n i c i t y i n f l u e n z a v i r u s.T h e a m i n o a c i d s a t p o s i t i o n190,225 a n d226o f t h e r e c e p t o rb i n d i n g s i t eo f HA g e n ew e r eD,Ea n dQ,r e s p e c t i v e l y,w h i c hs u g g e s t e d t h a t i t h a dt h e p o t e n t i a l a b i l i t y t ob i n dt ot h eh u m a ns a l i v a r y a c i dr e c e p t o ra n d i ta l s oh a dt h e p o t e n t i a l t ob i n da v i a ns i a l i ca c i dr e c e p t o r s.N o n eo f t h ea m i n oa c i dr e s i d u e so f N A g e n ew e r e m u t a t e d,s u g g e s t i n g t h a t t h e i s o l a t ew a s s e n s i t i v e t on e u r a m i n i d a s e i n h i b i t o r s s u c ha s o s e l t a m i v i r a n d z a n a m i v i r.H o w e v e r,t h em u t a t i o n s a t t h r e e a m i n o a c i d s i t e s i n M g e n ew e r eV27A,A30Ta n d D44A,s u g g e s t i n g a ni n c r e a s e dr e s i s t a n c et oa m a n t a d i n e-b a s e dd r u g s.ʌC o n c l u s i o nɔT h es t r a i n i s o l a t e da n di d e n t i f i e di nt h i ss t u d y w a sa G4E u r a s i a na v i a n-l i k eS w i n ei n f l u e n z av i r u s.T h e a n a l y s i s o f k e y a m i n oa c i ds i t e ss u g g e s t e dt h a t t h i ss t r a i nh a dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f a d a p t i n g t o r e p l i c a t i o na n d e n h a n c i n g v i r u l e n c e i nm a m m a l s.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d yp r o v i d e d r e f e r e n c e d a t a f o r t h e p r e v e n t i o na n d c o n t r o l o f s w i n e i n f l u e n z a i nG u a n g d o n g.K e y w o r d s:E u r a s i a n a v i a n-l i k e S w i n ei n f l u e n z a v i r u s;i s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n;s e q u e n c e a n a l y s i s;H1N1s u b t y p e猪流感是由猪流感病毒(S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,S I V)引起的猪的一种急性呼吸道传染病,临床症状以咳嗽㊁流鼻涕㊁发热㊁食欲减退为主[1]㊂猪的呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6两种唾液酸(s i a l i c a c i d,S A)受体,能感染人流感病毒和禽流感病毒,不同流感病毒同时感染猪时极易发生基因重排而产生新的流行毒株,所以猪被认为是流感病毒发生基因重排的混合器 [2-3]㊂流感病毒的重排是产生具有新抗原性和生物学特性的子代病毒的主要机制,可导致流感灾难性的大流行㊂不同亚型S I V在世界范围内猪群中呈地区性流行,其中以H1N1亚型S I V最为常见㊂H1N1亚型S I V又可分为经典H1N1亚型(C l a s s i c a l s w i n e i n f l u e n z a v i r u s,C S H1N1S I V)和欧亚类禽H1N1亚型(E u r a s i a na v i a n-l i k e H1N1S w i n ei n f l u e n z a v i r u s,E A H1N1S I V)等㊂E A H1N1亚型S I V于1979年在欧洲猪群中首次被报道,之后欧洲H1N1亚型S I V主体变成了E A H1N1亚型S I V[4]㊂中国E A H1N1分支于2001年首先报道于香港,随后在各地猪群中传播开来,分离率不断上升,目前已成为中国猪群中流行的优势毒株[5]㊂2009年,墨西哥暴发了席卷全球人群的甲型H1N1(P a n d e m i cH1N1 i n2009,p d m/09H1N1)流感病毒,成为21世纪第1次流感大流行,在全球范围内造成18000多人死亡[6]㊂大流行之后p d m/09H1N1毒株在人群中持续传播并传入猪群,p d m/09H1N1毒株在猪群中与E A H1N1亚型S I V等多种流行病毒发生基因重排,极大地危害了人类的公共健康[7]㊂2018年,猪群中E A H1N1亚型S I V与p d m/09H1N1亚型S I V等重排形成了多种基因型,其中G4基因型的重排方式是:HA和N A基因来自于E A H1N1亚型S I V,N S基因来自北美三源重排S I V,其余内部基因来自p d m/09H1N1亚型S I V[8-10],因此,这种G4基因型病毒对公共卫生构成更严重的威胁㊂目前,E A H1N1亚型S I V在中国南方的猪群中广泛传播,给人类健康带来严重威胁[11-12],因此,监测该地区S I V的流行和变异情况具有重要意义㊂2022年12月,在广东某猪场采集一批猪鼻拭子和肺脏组织样品,进行病毒分离鉴定,并对分离病毒进行全基因组基因测序和遗传进化分析,以了解分离病毒的起源及遗传进化特征,为广东省猪流感综合防控提供参考依据㊂1材料与方法1.1病料、S P F鸡胚病料为采集于广东省某猪场的猪肺脏组织和鼻拭子;9~10日龄S P F鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司㊂3461中国畜牧兽医51卷1.2主要试剂2ˑP h a n t aM a x M a s t e rM i x(D y eP l u s)㊁R N A 提取试剂盒(R N AI s o l a t e rT o t a lR N A E x t r a c t i o n R e a g e n t)㊁反转录试剂盒(H i S c r i p tⅡ1s tS t r a n d c D N AS y n t h e s i sK i t)㊁胶回收试剂盒(F a s t P u r eG e l D N A E x t r a c t i o n M i n iK i t)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;D L2000D N A M a r k e r购自天根生化科技(北京)有限公司㊂1.3病毒分离、鉴定及纯化将肺脏组织研磨液和鼻拭子液8000r/m i n离心5m i n,取上清过0.22μm滤膜除菌,接种于9~ 10日龄S P F鸡胚尿囊腔中,于37ħ恒温培养箱培养,去除24h内死亡鸡胚,72h后收集鸡胚尿囊液㊂按照上述方法将尿囊液再次接种鸡胚盲传2代,收集第3代尿囊液,通过S I V实时荧光定量R T-P C R 检测方法[13]和鸡红细胞凝集试验鉴定获得的病毒液,于-80ħ保存备用㊂鸡红细胞凝集试验是在V 形孔微量血凝板上将1%鸡红细胞与不同倍比稀释度的病毒反应,将血凝板倾斜70ʎ,观察沉淀于孔底的红细胞是否向下呈线状流动,以出现全部凝集(红细胞无流动)的最大稀释度为本分离株的血凝效价㊂1.4病毒全基因组扩增按照R N A提取试剂盒说明书提取病毒R N A,使用反转录通用引物(U n i12:5'-A G C A A A A G C A-G G-3')按照反转录试剂盒使用说明书进行反转录,合成c D N A㊂P C R引物参照H o f f m a n n等[14]建立的流感病毒全基因扩增方法合成,引物信息见表1㊂引物均由金唯智生物科技有限公司合成㊂根据高保真酶2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e P l u s)说明书分别扩增分离株的8个基因(P B1㊁P B2㊁P A㊁H A㊁N A㊁N P㊁M和N S基因)节段㊂P C R反应体系50μL:2ˑP h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y e p l u s)25μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各2μL,c D N A模板3μL,d d H2O补至50μL㊂P C R反应条件:95ħ预变性3m i n;95ħ变性15s,58ħ退火15s,72ħ延伸2m i n,共35个循环;72ħ延伸5m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定㊂扩增产物用胶回收试剂盒回收并送金唯智生物科技有限公司进行测序㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物大小P r o d u c t s i z e/b pP B2F:T A T T G G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T C G T T T2341 P B1F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G C A T T T2341 P A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C G A A A G C A G G T C A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A C T T2233 H A F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T1778 N A F:T A T T G G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G A G T R:A T A T G G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G A G T T T T T T1565 N P F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T A R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T A T T T T T1413 M F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G T A G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G T A G T T T T T1027 N S F:T A T T C G T C T C A G G G A G C A A A A G C A G G G T G R:A T A T C G T C T C G T A T T A G T A G A A A C A A G G G T G T T T T8901.5病毒遗传进化分析测序结果通过S e q M a n软件拼接,N C B I网站在线B L A S T进行序列比对㊁相似性分析,通过N e t N G l y c1.0软件(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e s/N e t N G l y c-1.0/)分析预测潜在糖基化位点,在G e n B a n k中下载参考序列,使用M e g a7.0基于N e i g h b o r-J o i n i n g方法构建遗传进化树,B o o t s t r a p值为1000㊂2结果2.1病毒分离鉴定经S I V实时荧光定量R T-P C R检测,鸡胚尿囊液样品C t值为20.88,判定为S I V核酸阳性(图1)㊂将收获的鸡胚尿囊液进行红细胞凝集试验,结果显示,有血凝性,血凝效价为1ʒ128㊂将分离得到的毒株命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022㊂2.2分离株全基因组测序通过R T-P C R对病毒的8个基因片段进行扩增,得到P B1㊁P B2㊁P A㊁HA㊁N A㊁N P㊁M和N S8个基因片段,大小分别为2341㊁2341㊁2233㊁1778㊁1565㊁1413㊁1027和890b p(图2),与预期目的条带大小相符㊂44614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析1,鸡胚尿囊液;2,阴性对照1,C h i c k e ne m b r y o a l l a n t o i c f l u i d ;2,N e g a t i v e c o n t r o l 图1 实时荧光定量R T -P C R 检测结果F i g.1 R e s u l t s o fR e a l -t i m e q u a n t i t a t i v eR T -P CR M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1~8,P B 1㊁P B 2㊁P A ㊁HA ㊁N A ㊁N P ㊁M 和N S 基因M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1-8,P B 1,P B 2,P A ,HA ,N A ,N P ,M a n d N S g e n e s ,r e s p e c t i v e l y图2 分离株各基因片段P C R 扩增结果电泳图F i g .2 E l e c t r o p h o r e s i so fP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t so fe a c h g e n e f r a gm e n t o f t h e i s o l a t e 2.3 遗传进化分析2.3.1 病毒全基因组相似性分析分离株A/s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022的8个基因片段与G e n B a n k 登录的基因序列比对结果显示,HA ㊁N A ㊁P B 2㊁N P 和M 基因均与2018年在北京出现的A/s w i n e /B e i j i n g/0301/2018(H 1N 1)相似性最高,核苷酸相似性分别为97.94%㊁97.60%㊁97.27%㊁98.31%和98.83%,因此,进一步判定分离毒株属于H 1N 1亚型毒株,并将其命名为A /s w i n e/G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1);P A 基因与A /s w i n e /S h a n d o n g /L Y 142/2017(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为97.65%;N S 基因与A /s w i n e /L i a o n i n g /C Y 1833/2020(H 1N 1)的核苷酸相似性最高,为98.86%;P B 1基因与A /s w i n e /A n h u i /H D 21/2020(H 1N 1))核苷酸相似性最高,为96.92%㊂2.3.2 H A 氨基酸序列分析分离毒株A/s w i n e /G u a n g d o n g /C J M 2/2022(H 1N 1)HA 基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R /G L ,与近年来E AH 1N 1亚型S I V H A 裂解位点氨基酸组成相同,裂解位点仅含有1个碱性氨基酸(R ),具有低致病性流感病毒的特征㊂利用N e t N G l y c 1.0软件预测H A 蛋白潜在糖基化位点,结果显示,H A 蛋白具有5个潜在的糖基化位点,分别为26N S T D ㊁38N V T V ㊁288N C T T ㊁493N G T Y 和552N G S L ㊂2.3.3 N A 氨基酸序列分析分离毒株A /s w i n e /G u a n g d o n g/C J M 2/2022(H 1N 1)N A 基因含有7个潜在糖基化位点,分别为44N Q S E ㊁58N N T W ㊁63N Q T Y ㊁68N V S N ㊁88N S S L ㊁146N G T V 和235N G S C,在58位多出1个潜在糖基化位点N N TW ㊂N A 蛋白氨基酸序列对神经氨酸酶抑制剂类药物如扎那米韦和奥司他韦的敏感位点119(E )㊁152(R )㊁275(H )㊁293(R )㊁295(N )的氨基酸残基均未发生突变㊂2.3.4 病毒表面基因遗传进化分析在N C B I 下载相关序列,通过M e g a 7.0分析软件,将分离株的HA 基因与G e n B a n k 中的C S H 1N 1㊁E AH 1N 1㊁类人型H 1N 1和p d m /09分支代表毒株进行比对分析并构建遗传进化树㊂结果显示,分离株的HA 基因位于E A H 1N 1进化分支(图3);由N A 基因进化树可看出,分离株的N A 基因也位于E A H 1N 1进化分支(图4)㊂5461中国畜牧兽医51卷图3 H A 基因进化树F i g .3 P h y l o ge n e t i c t r e e of H Ag e ne 图4 N A 基因进化树F i g .4 P h y l o ge n e t i c t r e e of N Ag e n e 64614期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析2.3.5内部片段基因序列位点分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)序列进行关键氨基酸位点比对分析㊂P B2蛋白氨基酸位点进行比对发现,T271A㊁A590S和A591R的组合发生了突变㊂P B2蛋白中第431位氨基酸发生了T431M突变,第588位氨基酸发生了T588I突变㊂P B1蛋白的氨基酸位点H436Y发生替换㊂P A蛋白的P224S㊁L295P㊁A515T位点发生替换㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点发生替换㊂M蛋白的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生替换㊂N S蛋白关键氨基酸位点没有发生突变㊂2.3.6内部片段基因遗传进化分析将分离株的内部片段基因(P B2㊁P B1㊁P A㊁N P㊁M和N S基因)进行遗传进化分析,绘制进化树㊂分离株的P B2㊁P B1㊁P A㊁N P和M基因遗传进化分析结果显示,均来位于p d m/09H1N1分支㊂而N S基因处于北美三源重组分支(图5)㊂通过对分离毒株A/ s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/2022(H1N1)的8个基因节段的序列分析发现,该毒株的HA和N A基因来源于E A H1N1分支,P B1㊁P B2㊁P A㊁N P和M基因来源于p d m09H1N1分支,N S基因来源于t r H1N2(N o r t hA m e r i c a n t r i p l e r e a s s o r t a n tH1N2)分支,这属于近几年流行的G4基因型E A H I N1 S I V㊂3讨论S I V可引起猪的高度传染性呼吸系统疾病,发病率高,传播速度快,使患病猪生产性能下降㊂此外,其对人类也有一定的感染性[15]㊂S I V的一个显著特性是通过不断的变异和进化来逃避宿主的免疫保护,从而引发新的流感暴发和流行㊂S I V的持续进化不仅改变了其毒力,还引发了更广泛的猪流感流行,严重威胁了公共卫生安全[16-17]㊂流感病毒H A蛋白受体结合区的特殊氨基酸位点是决定其宿主范围的关键因素,H1亚型流感病毒唾液酸受体结合能力一般取决于第190和225位氨基酸,分离株A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)中HA基因第190和225位氨基酸分别为D㊁E,第226位氨基酸为Q,表明其既具备结合S Aα-2,6-G a l型人流感病毒S A受体的特点,也有结合S Aα-2,3-G a l型禽流感病毒S A受体的可能[18]㊂A型流感病毒P B2蛋白上的627和701位点是影响病毒致病性的关键位点,如发生E627K或D701N突变会显著提高病毒毒力[19],本试验分离毒株未发现这两个位点的突变㊂本试验中,S I V P B2蛋白的T271A㊁A590S和A591R的组合发生突变,有研究表明,这有利于S I V在哺乳动物宿主中的复制效率和毒力[20]㊂P B2蛋白中单个氨基酸T431M 发生突变,该氨基酸的突变对于E A H1N1亚型S I V在小鼠体内的毒力中起着关键作用,会显著增强E A H1N1亚型S I V在小鼠中的毒力[21]㊂分离株的P B1蛋白氨基酸位点H436Y和P A蛋白P224S位点发生相同的突变,这2个位点的突变有助于增强病毒在小鼠身上的毒力[22]㊂N P蛋白中K319N㊁Q357K位点突变,同样表明增强了对小鼠的致病性[23]㊂M基因的V27A㊁A30T㊁D44A位点发生突变,提示分离株可能对金刚烷胺类药物耐药性增加[24]㊂G4基因型S I V自2016年以来在中国逐渐形成流行趋势,主要在猪群中传播[25]㊂该基因型毒株是来源于3种谱系的重排方式,包括E A H1N1㊁p d m/09H1N1病毒,以及综合了禽类㊁人类和猪的流感病毒基因的北美三源重组t r H1N2病毒,中国南方地区生态㊁地理和气候环境独特,猪场㊁鸡场密集及人和畜禽的频繁接触,有利于S I V的变异和流行[26]㊂分离毒株基因片段HA㊁N A与来自E A H1N1亚型S I V相似性较高,部分基因片段与p d m/09H1N1相似性较高,与北京㊁安徽㊁辽宁等省份的片段高度同源,提示分离株可能是在人流感病毒感染猪及生猪跨区域流动过程中重排产生㊂随着S I V的变异和与其他亚型病毒的重组,其跨种间传播的能力和感染人的风险也逐步增强㊂因此,加强对华南地区S I V的监测对公共卫生具有重要意义㊂对于养猪业来说,要采取有效的预防和控制措施,如定期消毒㊁加强饲养管理㊁提高猪群的免疫力等,以减少猪流感的发生和传播㊂74618461中国畜牧兽医51卷A~F,分别为P B1㊁P B2㊁P A㊁N P㊁M和N S基因A-F,P B1,P B2,P A,N P,M a n d N S g e n e s,r e s p e c t i v e l y图5内部片段基因进化树F i g.5P h y l o g e n e t i c t r e e o f i n t e r n a l f r a g m e n t s4期韩慧等:1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析4结论本研究分离到1株G4型欧亚类禽猪流感病毒(H1N1),将其命名为A/s w i n e/G u a n g d o n g/C J M2/ 2022(H1N1)㊂HA基因裂解位点氨基酸序列为P S I Q S R/G L具有低致病性流感病毒的分子特征,但在不同基因片段的关键氨基酸位点上发生了突变,这可能增强毒力和对哺乳动物的致病性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]黄良宗,颜广智,邓汝森,等.猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析[J].中国畜牧兽医,2020,47(8):2625-2633.HU A N GLZ,Y A N GZ,D E N G RS,e t a l.I s o l a t i o n,i d e n t i f i c a t i o na n d g e n e t i ce v o l u t i o na n a l y s i so fS w i n ei n f l u e n z av i r u sf r o m G u a n g d o n g p r o v i n c e[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2020,47(8):2625-2633.(i nC h i n e s e)[2]I T O T,C O U C E I R O J N,K E l M S,e t 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禽流感病毒诊断技术研究进展

禽流感病毒诊断技术研究进展一、引言禽流感是一种高致病性病毒性疾病，目前已在世界范围内造成大量的家禽死亡和经济损失。

禽流感病毒的快速检测和准确诊断对于疫情的防控和阻断至关重要。

该文将介绍目前禽流感病毒诊断技术的研究进展。

二、免疫学诊断技术1. 细胞培养法细胞培养法是禽流感病毒的最早诊断方法之一，通过将感染样品接种细胞培养物中，观察是否有细胞损伤和病毒分离情况。

但由于该方法需要特定实验室条件，并且需要较长时间，因此已渐被其他更先进的诊断技术所取代。

2. 补体结合反应（CFT）CFT是一种免疫学诊断方法，它通过观察血清中禽流感特异性抗体和禽流感病毒抗原之间的补体结合情况来诊断病毒。

但是，由于该方法对试剂质量和操作技巧要求较高，且存在假阴性和假阳性等问题，因此不常用于临床检测。

3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是一种快速、准确和经济的诊断方法。

该方法利用特异性抗体与抗原之间的特异性结合，通过酶标记活性物质，使结合物可定量检测。

目前，ELISA已被广泛应用于疫情监测和疫苗效果评估等方面。

4. 荧光素酶联免疫吸附试验（F-ELISA）F-ELISA是一种对传统ELISA方法的改进，它利用荧光素作为标记物，从而提高了灵敏度和特异性。

F-ELISA操作简单、快速、可靠，已被广泛用于临床检测和疫情监测。

三、分子诊断技术1. 聚合酶链反应（PCR）PCR是一种高度敏感和特异的分子诊断技术，它能够从样品中扩增病毒DNA或RNA片段，从而进行病毒诊断。

PCR具有快速、准确、可靠的优点，因此已成为禽流感病毒诊断的首选方法之一。

2. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）RT-qPCR将常规PCR与荧光标记技术相结合，能够快速、准确地扩增、检测禽流感病毒。

该方法可用于样品的快速筛选和诊断。

此外，RT-qPCR还可用于研究禽流感病毒的毒株差异和基因变异。

3. 巢式PCR巢式PCR是将PCR的灵敏度和特异性提高到更高水平的方法。

禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定

禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定李凤艳【摘要】对2013～2015年从各省养鸡场采集的口腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品,对其进行纯化得到4株H9亚型禽流感病毒,用针对H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段后进行测序分析,结果显示4个分离株经鉴定均为H9亚型禽流感病毒.对4个分离株的生物学特性进行研究,发现4株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】6页(P11-16)【关键词】H9亚型禽流感病毒;分离鉴定;生物学特性【作者】李凤艳【作者单位】辽宁益康生物股份有限公司,辽宁辽阳111000【正文语种】中文【中图分类】S858.28禽流行性感冒，简称禽流感（Avian lnflucnza，AI），是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）、流感病毒属、A型流感病毒所引起的一种禽类传染病，OIE根据对家禽所造成的疾病程度，禽流感被分为高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（lowlypathogenic avian influenza virus， LPAIV）。

H9亚型AIV属于LPAIV，是家禽中最常见的病毒之一。

H9N2亚型AIV最早于1966年从火鸡体内分离到[1]。

此后H9亚型的禽流感病毒也从许国国家的家禽和水禽中分离到[2]。

H9N2亚型AIV在我国广泛存在，且多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势[3]。

多数携带该病毒的野禽、水禽、家禽并不表现出临床症状或仅表现轻微临床症状，一旦出现临床症状多表现为呼吸系统症状、蛋鸡产蛋下降、肉鸡生长迟缓等，是影响我国养禽业发展的重要病原。

因此，关注H9N2亚型AIV的研究具有普遍的公共卫生意义。

鹅源禽流感病毒株的分离鉴定及其致病性实验研究的开题报告

鹅源禽流感病毒株的分离鉴定及其致病性实验研究的开题报告一、选题背景和意义禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，在全球范围内广泛存在。

目前，主要病原体有H5N1、H7N9、H9N2等亚型病毒，其中H5N1病毒对家禽和人类的致病性高，并具有高度致死性。

鹅源禽流感病毒是一种新出现的禽流感病毒亚型，其致病性和传播性等特征还需进一步明确。

因此，为了更好地防范禽流感疫情的发生和流行，有必要对鹅源禽流感病毒进行分离鉴定及其致病性实验研究。

二、选题研究内容和方法1. 鹅源禽流感病毒的分离鉴定：从鹅源反应阳性的样品中提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测，筛选出病毒阳性样品，再经过病毒分离和传代，最终确定鹅源禽流感病毒株。

2. 鹅源禽流感病毒的致病性实验研究：利用已分离出的鹅源禽流感病毒株，进行动物实验研究，观察其感染不同动物后的致病性和传染性等指标。

三、预期研究结果和意义1. 鉴定出一株具有代表性的鹅源禽流感病毒株，为后续相关研究提供实验基础；2. 分析鹅源禽流感病毒株的致病性特征和传播途径，探讨防控鹅源禽流感疫情的有效措施，为保障家禽产业和公共健康作出贡献；3. 丰富禽流感病毒的分类和特征，为研究不同禽流感病毒亚型的传染性和致病性提供参考。

四、研究方案和预算1. 研究方案：（1）样品采集和处理（2）RNA提取和RT-PCR检测（3）ELISA检测和病毒筛选（4）病毒分离和传代（5）动物实验研究2. 预算：包括实验室耗材费用、动物试验费用、实验室人员工资、设备折旧等费用，总计50万元。

五、进度安排1. 第一年：完成样品采集和处理、RNA提取和RT-PCR检测、ELISA检测和病毒筛选等工作，并初步筛选出病毒阳性样品。

2. 第二年：进行鹅源禽流感病毒的分离和传代，并确定出一株具有代表性的病毒株。

3. 第三年：进行动物实验研究，观察鹅源禽流感病毒株的致病性和传染性等指标，并分析研究结果。

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禽流感病毒的分离与鉴定研究
禽流感是一种由禽流感病毒引起的急性传染病。

该病毒主要影响禽类，但也有可能感染人类，并且一旦发生大规模爆发，将对畜牧业、禽类养殖业以及全球经济造成重大影响。

因此，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究至关重要。

分离方法
禽流感病毒分离最常用的方法是直接病毒分离法和传代病毒分离法。

直接病毒分离法是将采集来的样品（充气囊液、肠道、气管、内脏等）进行磨碎、过筛后，加入细胞培养基中，通过激活剂或其他手段激发细胞后将病毒从培养基中筛选出来。

传代病毒分离法是将直接病毒分离法筛选出来的病毒，在细胞培养基中通过不断传代，逐渐升高病毒浓度，获得目标病毒菌株。

鉴定方法
病毒鉴定是确定所分离的病毒种类的一系列实验。

鉴定方法包括：病理学观察、抗原鉴定和核酸检测。

病理学观察法通常采用组织学、细胞学等方法观察病毒的组织病变和病变情况，以及确定细胞的形态变化和能力损失情况。

抗原鉴定法通过病毒对特异性抗体和特异性酶的反应来鉴定病毒的类型。

常用的抗原鉴定法有酶联免疫吸附试验、荧光免疫分析法、放射免疫分析法等。

核酸检测法是通过核酸杂交技术、PCR扩增和序列分析等方法
来鉴定病毒。

其中，PCR扩增技术是最常用的方法之一。

PCR扩
增技术可以选择病毒特异性的保守区域，扩增出目标片段，用于
比对成果，确认病毒的种类和亚型。

研究进展
目前，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究已经取得了一定的进展。

例如，利用新一代测序技术，成功对H9N2亚型进行了全基
因组测序和比对，揭示了其与其他亚型的基因组演化关系；同时，也研制出了多种疫苗和抗体，为禽流感的预防和治疗提供了有力
的手段。

但是，禽流感病毒的分离与鉴定研究依然存在一些问题，如病
毒分离效率低、鉴定方法繁琐、检测灵敏度低等。

为了进一步提
高病毒分离和鉴定的精度和效率，需要加强技术研发和人才培养。

总之，禽流感病毒的分离与鉴定研究是保障人民生命健康和畜
牧业发展的重要科学问题。

虽然已取得了一定的进展，但研究仍
然任重道远，需要继续深入推进。