最新9蛋白质的化学修饰
合集下载
蛋白质的化学修饰
转移
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
蛋白质的化学修饰
终止修饰反应的方法
加入某种化学试剂(通常为氨基酸 与修饰剂反应 加入某种化学试剂 通常为氨基酸)与修饰剂反应，从而消耗 通常为氨基酸 与修饰剂反应， 掉游离的修饰剂； 掉游离的修饰剂； 通过洗滤、 通过洗滤、超滤或透析将修饰蛋白与未修饰蛋白和游离的修 饰剂分开； 饰剂分开； 改变反应条件，如反应的pH值等 使修饰反应停止。 值等， 改变反应条件，如反应的 值等，使修饰反应停止。
pH：多数情况下，在蛋白质等电点附近的pH范围内，增加 ：多数情况下，在蛋白质等电点附近的 范围内， 范围内 pH可以提高反应速率，降低 可以减小反应速率。 可以提高反应速率， 可以减小反应速率。 可以提高反应速率 降低pH可以减小反应速率 反应活性较高的修饰剂在中性或近中性的pH下即可以与蛋 反应活性较高的修饰剂在中性或近中性的 下即可以与蛋 白质迅速偶合；而反应活性较低的修饰剂则需要较高的pH。 白质迅速偶合；而反应活性较低的修饰剂则需要较高的 。
蛋白质侧链基团的化学修饰(以下简称化学修饰 蛋白质侧链基团的化学修饰 以下简称化学修饰) 以下简称化学修饰
通过选择性试剂(下称修饰剂) 通过选择性试剂(下称修饰剂)或亲和标记试剂与蛋白质分子侧 链上特定的功能基团(下称功能基)发生化学反应而实现的; 链上特定的功能基团(下称功能基)发生化学反应而实现的; 应用： 应用： 酶和蛋白质的各级结构以及作用机理； 酶和蛋白质的各级结构以及作用机理； 蛋白质纯度分析与鉴定； 蛋白质纯度分析与鉴定； 蛋白质和酶分子的固定化； 蛋白质和酶分子的固定化； 蛋白质分子的改性
蛋白质的化学修饰
定义 通过活性基团的引入或除去， 通过活性基团的引入或除去，而使蛋白质一级结构发生改 变的过程，统称为蛋白质的化学修饰。 变的过程，统称为蛋白质的化学修饰。 蛋白质的化学修饰主要包括两个方面： 蛋白质的化学修饰主要包括两个方面：
蛋白质的化学修饰
2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要 用于-S-S-的还原剂。
连四硫酸钠或钾 是一温和的氧化剂， 常用于-SH的可逆 保护剂。
2.1.4 芳香环取代反应
蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲 电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典 型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的 酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特 殊光谱，可用于直接的定量测定。
-H2O
[H]
P-NH2 + RCHO +H2O P-N=CHR
P-NH-CH2R
2.3.2 电荷消失的修饰
这 不带类电试。剂可抑制Lys--NH2的质子化, 使形成的衍生物 1. 乙酰化：在微碱性pH下，氨基与乙酸酐反应生成 乙酰化衍生物。
2. 芳香化：三硝基苯磺酸与氨基作用, 生成的衍生物 为黄色，可定量测定-NH2。 (其它:DNFB\DNS)
2.1 特定的AA残基侧链 基团的反应试剂（4种）
2.1.1 酰化及其相关反应
这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、 硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温 (20ºC~25ºC)，pH 4.5 ~9.0的条件下可与蛋白质某些 侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化 反应。
2.1.2 烷基化反应
此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯 甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子， 因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋 白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。
2.1.3 氧化和还原反应
H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能 将侧链基团( -SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧 化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光 敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。
连四硫酸钠或钾 是一温和的氧化剂， 常用于-SH的可逆 保护剂。
2.1.4 芳香环取代反应
蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲 电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典 型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的 酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特 殊光谱，可用于直接的定量测定。
-H2O
[H]
P-NH2 + RCHO +H2O P-N=CHR
P-NH-CH2R
2.3.2 电荷消失的修饰
这 不带类电试。剂可抑制Lys--NH2的质子化, 使形成的衍生物 1. 乙酰化：在微碱性pH下，氨基与乙酸酐反应生成 乙酰化衍生物。
2. 芳香化：三硝基苯磺酸与氨基作用, 生成的衍生物 为黄色，可定量测定-NH2。 (其它:DNFB\DNS)
2.1 特定的AA残基侧链 基团的反应试剂（4种）
2.1.1 酰化及其相关反应
这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、 硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温 (20ºC~25ºC)，pH 4.5 ~9.0的条件下可与蛋白质某些 侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化 反应。
2.1.2 烷基化反应
此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯 甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子， 因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋 白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。
2.1.3 氧化和还原反应
H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能 将侧链基团( -SH\-SCH3\吲哚基\咪唑基和酚基)氧 化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光 敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。
蛋白质的化学修饰
从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去， 而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白 质的化学修饰。
包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2） 主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而 后者则属于基因重组和定点突变的方法。
a
46
蛋白质化学修饰的意义
改变蛋白质的药代动力学 调节蛋白质的稳定性以及活性 改变蛋白质的空间构象
6. 10% SDS
取10g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。
7. 10%过硫酸铵溶液（AP）
临用前现配。
a
20
8．染色液（0.25% R-250、50%甲醇、7%乙酸）
考马斯亮蓝R-250 2.5 g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 500 ml、70 ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000 ml。
4. 0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液pH6.8 （4x）
取5.98 g Tris，用1N HCl调至pH6.8，加水至 100 ml，4℃保存。
a
19
5. 电极缓冲液（pH 8.3）
取 14.49 g甘氨酸，3.02 g Tris，加100 ml 10%SDS，加水至1 升，4℃保存。
a
49
2 反应条件的选择
考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以 及缓冲液组成
允许反应顺利进行
不能造成蛋白质的不可逆变性
有利于专一性修饰蛋白质
a
50
修饰反应的类型
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
a
51
二硝基氟苯法(FDNB,DNFaB): 1945年Sanger提出此方法.52
a
25
样品预处理
取样品液与等体积样品缓冲液混合，100℃加热 1～2分钟。
包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2） 主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而 后者则属于基因重组和定点突变的方法。
a
46
蛋白质化学修饰的意义
改变蛋白质的药代动力学 调节蛋白质的稳定性以及活性 改变蛋白质的空间构象
6. 10% SDS
取10g SDS，加水至100 ml，完全溶解后室温保存。
7. 10%过硫酸铵溶液（AP）
临用前现配。
a
20
8．染色液（0.25% R-250、50%甲醇、7%乙酸）
考马斯亮蓝R-250 2.5 g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 500 ml、70 ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000 ml。
4. 0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液pH6.8 （4x）
取5.98 g Tris，用1N HCl调至pH6.8，加水至 100 ml，4℃保存。
a
19
5. 电极缓冲液（pH 8.3）
取 14.49 g甘氨酸，3.02 g Tris，加100 ml 10%SDS，加水至1 升，4℃保存。
a
49
2 反应条件的选择
考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以 及缓冲液组成
允许反应顺利进行
不能造成蛋白质的不可逆变性
有利于专一性修饰蛋白质
a
50
修饰反应的类型
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
a
51
二硝基氟苯法(FDNB,DNFaB): 1945年Sanger提出此方法.52
a
25
样品预处理
取样品液与等体积样品缓冲液混合，100℃加热 1～2分钟。
蛋白质化学修饰及其在疾病中的作用
蛋白质化学修饰及其在疾病中的作用蛋白质是机体中最基本的分子单位之一，它们在生命活动中起着至关重要的作用。
然而，在细胞内，蛋白质的结构和功能可能会受到化学修饰的影响。
化学修饰指的是对蛋白质分子的特定位点进行化学反应，从而改变它们的性质。
蛋白质化学修饰在疾病的发生和发展中起着重要的作用，下面就来详细探讨一下。
1. 药物治疗中的蛋白质化学修饰药物治疗是今天医疗手段的主要形式之一，而蛋白质化学修饰也是药物治疗中不可或缺的一环。
在诊断和治疗肿瘤疾病中，抗体药物是一种常见的治疗方式。
这些药物通过与癌细胞表面的蛋白质相互作用，并针对特定癌细胞表面的蛋白质进行化学修饰，以产生杀灭癌细胞的效果。
治疗慢性疾病如糖尿病和精神病的药物也会通过蛋白质化学修饰，以改变它们的生物分布和代谢。
许多药物都可以通过蛋白支架等方式实现蛋白质化学修饰。
2. 蛋白质化学修饰与脑疾病脑疾病是近年来引起人们高度重视的健康问题之一。
研究表明，在神经元发育和突触后期的形成中，蛋白质的化学修饰是至关重要的。
在脑疾病的发展中，许多蛋白质分子经常出现异常的化学修饰，如糖基化、磷酸化等。
这些异常化学修饰导致蛋白质失去正常功能，从而导致脑疾病的发生。
研究表明，通过化学修饰对蛋白质进行特定的标记，可以提高诊断和预防脑疾病的准确性。
3. 蛋白质化学修饰在肿瘤中的应用肿瘤是一种危及人类生命健康的疾病。
许多研究者们利用蛋白质化学修饰技术来防治肿瘤。
实验也证明，许多蛋白质在肿瘤细胞中会出现异常的化学修饰，如葡萄糖酸化、乙酰化等。
针对这些异常，许多研究者通过蛋白质化学修饰对肿瘤细胞分子进行标记，以提高治疗效果。
这些蛋白质化学修饰技术的使用已经引起了许多研究者的兴趣，大力推进这项研究。
4. 蛋白质化学修饰及其未来的应用前景蛋白质化学修饰是一项在细胞内机理和生物学研究领域广泛应用的技术。
通过化学修饰对蛋白质标记，可以达到了解细胞生物分子及其结构、发现生物标志物、临床诊断和药物研制等目的。
蛋白质的修饰和表达
影响化学修饰旳主要原因有两方面：
1、蛋白质功能基旳活性反应，涉及基团之 间旳氢键和静电作用等，基团之间旳旳空 间阻力。
2、修饰剂旳反应活性。
一、蛋白质侧链旳化学修饰
在20种天然氨基酸旳侧链中，大约有二分之一能够在足够 温和旳条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、 巯基和羧基尤其轻易产生有用旳取代。
（一）亲和标识
亲和标识是一类位点专一性旳化学修饰， 试剂能够专一性标识于酶旳活性部位上， 使酶不可逆旳失活，所以又称为专一性旳 不可逆克制作用。
此类克制剂可分为两类：
一类是Ks型旳不可逆克制剂，它是根据底 物旳构造设计旳，它具有和底物构造相同 旳结合集团，同步还具有和活性部位氨基 酸残基旳侧链基团反应旳活性基团。
蛋白质旳化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一种化学惰性旳水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
蛋白质分子旳固定化
蛋白质分子旳固定主要是酶分子旳固定。 酶旳固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有旳催化反应，并可 回收及反复使用旳一类技术。 优点：1、既能保持酶旳活性又能克服游离酶旳某 些不足，提升酶分子旳稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活旳环节， 简化生产工艺 4、酶可在生产中反复利用，提升了酶旳利用率。
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子 互换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。4）载体交联法：用多功能试剂旳一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中 旳另一部分功能集团偶联酶蛋白。
2、共价结正当
是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面 上旳反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶旳措施。
常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
蛋白质的化学修饰和结构改造(精品)
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一 性的修饰反应。
（3）反应体系中蛋白质与修饰剂的比例
3 蛋白质的化学修饰方法
1. 金属离子置换修饰 2. 大分子结合修饰(共价/非共价)：重点 3. 蛋白质侧链基团的化学修饰 4. 肽链有限水解修饰
(1) 蛋白质/酶的金属离子置换修饰
小分子药物进行PEG修饰后,能够显著改善难溶药 物的水溶性,如PEG紫杉醇;
改善药动学参数,如PEG - 阿霉素、PEG阿糖胞昔。
蛋白药物的聚乙二醇修饰途径
氨基修饰 羧基修饰 巯基修饰 其他：
如控制pH实现mPEG选择性修饰蛋白质中的组 氨酸侧链的咪唑基团；
用谷氨酰胺转氨酶将mPEG - NH2转移到蛋白 质的谷氨酸侧链上,实现对谷氨酰胺的选择性修 饰
修饰：将修饰剂与蛋白在一定的温度、pH值等条件 下反应一段时间。
分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离。
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶 性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消 除蛋白质的抗原性，使其末端活化后可以与蛋白质 产生交联，被广泛用于蛋白质的修饰。
酶
天然SOD
右旋糖酐-SOD Ficoll(低分子量)–SOD Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
④PEG可以将它的许多优良性质赋予修饰后的生物 分子。
PEG修饰对蛋白质的影响
降低蛋白的免疫原性：
作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇， 避免抗体的产生，或者阻挡抗体抗原的结合
延长体内半衰期
分子量增加，减少肾小球滤过； 减少抗体的中和作用 保护蛋白不被蛋白酶水解
聚乙二醇修饰药物的优势
第三章 蛋白质结构改造
主要内容
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一 性的修饰反应。
（3）反应体系中蛋白质与修饰剂的比例
3 蛋白质的化学修饰方法
1. 金属离子置换修饰 2. 大分子结合修饰(共价/非共价)：重点 3. 蛋白质侧链基团的化学修饰 4. 肽链有限水解修饰
(1) 蛋白质/酶的金属离子置换修饰
小分子药物进行PEG修饰后,能够显著改善难溶药 物的水溶性,如PEG紫杉醇;
改善药动学参数,如PEG - 阿霉素、PEG阿糖胞昔。
蛋白药物的聚乙二醇修饰途径
氨基修饰 羧基修饰 巯基修饰 其他：
如控制pH实现mPEG选择性修饰蛋白质中的组 氨酸侧链的咪唑基团；
用谷氨酰胺转氨酶将mPEG - NH2转移到蛋白 质的谷氨酸侧链上,实现对谷氨酰胺的选择性修 饰
修饰：将修饰剂与蛋白在一定的温度、pH值等条件 下反应一段时间。
分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离。
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶 性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消 除蛋白质的抗原性，使其末端活化后可以与蛋白质 产生交联，被广泛用于蛋白质的修饰。
酶
天然SOD
右旋糖酐-SOD Ficoll(低分子量)–SOD Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
④PEG可以将它的许多优良性质赋予修饰后的生物 分子。
PEG修饰对蛋白质的影响
降低蛋白的免疫原性：
作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇， 避免抗体的产生，或者阻挡抗体抗原的结合
延长体内半衰期
分子量增加，减少肾小球滤过； 减少抗体的中和作用 保护蛋白不被蛋白酶水解
聚乙二醇修饰药物的优势
第三章 蛋白质结构改造
主要内容
蛋白质分子的化学修饰课件
磷酸酶
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白 质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质 的构象或活性位点，从而 调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转 导过程中起着关键作用， 可影响细胞生长、分化、 代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质 的稳定性，通过调节蛋白 质降解途径来影响细胞内 蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基 基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基 团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团 ，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟 基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂 。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催 化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基 。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性
催化去磷酸化反应的酶，将蛋白 质上的磷酸基团去除。
蛋白质磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类
调节蛋白质活性
磷酸化修饰可改变蛋白质 的构象或活性位点，从而 调节其功能。
参与信号转导
磷酸化修饰在细胞信号转 导过程中起着关键作用， 可影响细胞生长、分化、 代谢等过程。
蛋白质稳定性
磷酸化修饰可影响蛋白质 的稳定性，通过调节蛋白 质降解途径来影响细胞内 蛋白质水平。
2023
PART 04
蛋白质甲基化修饰
REPORTING
甲基化修饰的种类
赖氨酸甲基化
赖氨酸残基的ε-氨基上加上甲基 基团，包括单甲基化、二甲基化
和三甲基化。
蛋氨酸甲基化
蛋氨酸残基的α-氨基上加上甲基基 团，通常为N-甲基化。
精氨酸甲基化
精氨酸残基的胍基上加上甲基基团 ，包括N-甲基化和N,N-二甲基化。
2023
PART 03
蛋白质糖基化修饰
REPORTING
糖基化修饰的种类
O-糖基化
糖基磷脂化
发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的羟 基上，由糖苷酶催化。
将糖基连接到脂质分子上，形成糖脂 。
N-糖基化
发生在蛋白质的氨基上，由糖苷酶催 化。
糖基化修饰的酶类
糖基转移酶
催化糖基从供体转移到受体上。
糖苷酶
催化糖苷键的断裂，释放出糖基 。
泛素化
泛素化是指将泛素分子加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的降解和功能。
甲基化
甲基化是指将甲基基团加到蛋 白质的特定位点上，可以调节 蛋白质的构象和与其他蛋白质
的相互作用。
蛋白质分子化学修饰的功能
调节蛋白质活性
调节蛋白质稳定性
蛋白修饰方式
蛋白修饰方式
蛋白质修饰是指在蛋白质合成后，通过化学反应或酶催化等方式对蛋白质的结构进行改变或功能进行调节的过程。
常见的蛋白质修饰方式包括：
1. 磷酸化（Phosphorylation）：通过添加磷酸基团，改变蛋白质的电荷分布和结构，从而调节蛋白质的活性、互作和定位等。
2. 乙酰化（Acetylation）：在蛋白质N-末端或赖氨酸残基上加入乙酰基，影响蛋白质的稳定性、亚细胞定位和相互作用等。
3. 甲基化（Methylation）：通过在蛋白质上引入甲基基团，调节蛋白质的结构和功能，涉及到细胞分化、基因表达和转录调控等过程。
4. 糖基化（Glycosylation）：在蛋白质上加入糖基，影响蛋白质的稳定性、溶解性和识别性，参与细胞信号传导、免疫应答等生物学过程。
5. 泛素化（Ubiquitination）：通过连接泛素分子到蛋白质上，调节蛋白质的稳定性和降解，参与细胞周期、DNA修复和免疫应答等过程。
这些是常见的蛋白质修饰方式，不同的修饰方式可以对蛋白质的结构和功能产生不同的影响，进而调节细胞内的生物学过程。
4.蛋白质的化学修饰
如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质 中反应，则应选择在水中有一定溶解性的试剂。 还必须考虑，反应生成物容易进行定量测定；试剂的 体积小一些为宜。
选择蛋白质修 饰剂要考虑：
修饰反应要完成到什么程度； 对个别氨基酸残基是否专一； 在反应条件下，修饰反应有没有限度； 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变； 是否需要分离修饰后的衍生物； 反应是否需要可逆； 是否适合于建立快速、方便的分析方法。
O ENZ C O C NH2 + OH-
O
N C NH2 O
3.芳基化
三硝基苯磺酸（TNBS）与氨基作用，产生三硝基苯衍生物，反 应产物为黄色。 TNBS也能与巯基作用。
NO2
NO2 SO3H + NH2R pH﹥7
NO2
TNBS
NO2
NO2 NHR + SO3H +H+
NO2
（黄色）
（三）引入负电荷的修饰
（一）试剂的选择
选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基；
修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。
如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性， 必须选择能引入最大电荷量的试剂。
1.利用蛋白质分子中，某些基团的特殊活性蛋白质，特殊的空 间结构，能影响某些基团的活性
位置专一性：在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身 发生作用，而其它基团皆不作用。
2.选择不同的反应pH
蛋白质分子中各功能基的解离常数是不同的，所以控制不同的反应pH，也 就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。
选择蛋白质修 饰剂要考虑：
修饰反应要完成到什么程度； 对个别氨基酸残基是否专一； 在反应条件下，修饰反应有没有限度； 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变； 是否需要分离修饰后的衍生物； 反应是否需要可逆； 是否适合于建立快速、方便的分析方法。
O ENZ C O C NH2 + OH-
O
N C NH2 O
3.芳基化
三硝基苯磺酸（TNBS）与氨基作用，产生三硝基苯衍生物，反 应产物为黄色。 TNBS也能与巯基作用。
NO2
NO2 SO3H + NH2R pH﹥7
NO2
TNBS
NO2
NO2 NHR + SO3H +H+
NO2
（黄色）
（三）引入负电荷的修饰
（一）试剂的选择
选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基；
修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。
如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性， 必须选择能引入最大电荷量的试剂。
1.利用蛋白质分子中，某些基团的特殊活性蛋白质，特殊的空 间结构，能影响某些基团的活性
位置专一性：在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下只是其本身 发生作用，而其它基团皆不作用。
2.选择不同的反应pH
蛋白质分子中各功能基的解离常数是不同的，所以控制不同的反应pH，也 就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。
蛋白质的化学修饰
蛋白质的化学修饰蛋白质化学修饰技术是现代生物技术发展的一个重要方向，以聚乙二醇(PEG)为修饰剂和以蛋白质为修饰剂是该技术的两个主要类型。
PEG修饰技术发展成熟，已经有几种PEG-蛋白质药物经过FDA 认证。
为了有效地检测和分离修饰产物，本论文首先用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效凝胶过滤、高效反相层析方法检测PEG修饰蛋白的组成。
随着PEG分子量的减少和被修饰蛋白分子量的增大，这三种常用方法的分辨率都相应降低。
重点考察了PEG修饰蛋白的SDS-PAGE 电泳过程，发现不带电的PEG分子在SDS 胶束的作用下参与了电场运动，从而导致分辨率下降。
改用没有SDS 的非变性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)后分辨率显著提高，未与白蛋白连接的PEG不参与电场运动，未修饰HSA和不同修饰程度的PEG-HSA偶联物得到有效的检测和分离。
进行了膜分离PEG修饰和未修饰蛋白质(和多肽)的考察。
被修饰物质的分子量和结构对分离效果有影响，低分子量的小肽可以通过膜分离与PEG-小肽偶联物完全分开。
传统的PEG反应方法中，产物是未修饰小肽(5％)、单修饰产物(42％)、二修饰和多修饰产物(53％)的混合物，而将膜分离与PEG修饰反应耦合，及时将PEG修饰产物移除，小肽100％转化成为单修饰的目标偶联物。
说明反应和分离耦合是提高PEG修饰反应产量和降低成本的有效途径。
从理论上讲，与PEG修饰相比，蛋白质类修饰剂具有代谢途径明确、可以提供靶向性和其他的生物活性的优点。
但是，蛋白质-蛋白质偶联反应的产物不均一、产物评价困难限制了其发展。
本文以戊二醛为交联剂采用人血清白蛋白(HSA)修饰血红蛋白，对修饰过程进行了探索。
考察了人血清白蛋白和血红蛋白的戊二醛一步交联反应，发现pH 是影响反应的关键因素。
在蛋白质的等电点附近发生蛋白质自身的聚合反应，而在两种蛋白质的等电点的平均值附近，两种蛋白质的偶联反应被促进。
第四讲蛋白质的化学修饰(共94张PPT)
二、确定修饰程度和修饰部位
通过对被修饰蛋白质的降解和氨基酸分析后鉴定修饰部 位。
通过纯化被修饰蛋白质的氨基酸及其衍生物，测定其同位素标 记量或光谱强度或顺磁共振谱或荧光标记量等来确定反应程度 。
一般认为：测定被修饰的氨基酸，要比测定氨基酸的减少 量更准确。
三、化学修饰数据的分析
⒈化学修饰的时间进程曲线 以修饰时间对蛋白质活性作图
蛋白质构象改变会导致微区极性的局部改变，这 种改变对
Trp，Met和Cys的反应性影响最小; 对氨基和咪唑基的反应性影响较大; 而对Tyr，Hcys和COOH的反应性影响最大
。此外，极性的变化也影响到反应类型。
⑵氢键效应
氢键对维持天然蛋白质及其离子稳定性有重要影响， 氢键的变化也可能导致pK发生改变。
S er O H
O H O C C H 2 C H 2
N O 2
⑸局部环境的极性
溶剂极性可能与反应速度有关，如下表：
反应类型
降低极性对速度的影响
⒈RSR+ICH2CONH2
[R2S+CH2CONH2]I- 适当或大大降低
⒉RSR+H2O2
R2SO+H2O
没有影响
⒊RS-+ ICH2CONH2
⒈试剂选择
不同实验，对修饰的专一性要求也不同，因此选择试剂在很大程 度上要依赖修饰目的。
例如，对氨基的修饰，仅修饰氨基；仅修饰α-氨基；修饰暴露的 或反应性高的氨基。
一般通过选择试剂和反应条件来控制修饰的部位和程度
•如果希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，应该选择能引入最大
电荷量的试剂。
•例如用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性条件下带正电荷的氨基转变成
蛋白质的化学修饰
E N Z S +I C H C O O 2
pH﹥7
E N Z S C H C O O + I 2
半胱氨酸
碘乙酸
副反应：
ENZ N N H 组氨酸
+I C H C O O 2
pH﹥5.5
E N Z N
C O O N C H 2
+ -+ + I H
E N Z S
甲硫氨酸
C H 3
I C H C O O + 2
S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸
（四）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基， 它与半胱氨酸形成混合二硫化物。 释放出的2-硝基-5-硫代苯
E N ZS N H+ O 2
O O C
S S
N O 2
C O O
pH ﹥6.5
DTNB
甲酸阴离子在412nm处有 吸收，可用光谱法测定其 含量。
O ENZ C O C R NH R NH
+
E N Z C
重排
O + H + N R C N H R
O
四、巯基的修饰
由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用 来修饰巯基侧链。 1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺 常用的有三类： 2.马来酰亚胺或马来酸酐 3.有机汞试剂 （一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或 组氨酸反应。
NO2 C H 2B r OH
pH ﹤7.5
+
ENZ NO 2 CH 2 O N HH
ENZ
+ HBr
2-羟基-5-硝基苄基溴
ENZ NH
色氨酸 醋酸
pH﹥7
E N Z S C H C O O + I 2
半胱氨酸
碘乙酸
副反应：
ENZ N N H 组氨酸
+I C H C O O 2
pH﹥5.5
E N Z N
C O O N C H 2
+ -+ + I H
E N Z S
甲硫氨酸
C H 3
I C H C O O + 2
S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸
（四）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基， 它与半胱氨酸形成混合二硫化物。 释放出的2-硝基-5-硫代苯
E N ZS N H+ O 2
O O C
S S
N O 2
C O O
pH ﹥6.5
DTNB
甲酸阴离子在412nm处有 吸收，可用光谱法测定其 含量。
O ENZ C O C R NH R NH
+
E N Z C
重排
O + H + N R C N H R
O
四、巯基的修饰
由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用 来修饰巯基侧链。 1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺 常用的有三类： 2.马来酰亚胺或马来酸酐 3.有机汞试剂 （一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或 组氨酸反应。
NO2 C H 2B r OH
pH ﹤7.5
+
ENZ NO 2 CH 2 O N HH
ENZ
+ HBr
2-羟基-5-硝基苄基溴
ENZ NH
色氨酸 醋酸
第四章 蛋白质的化学修饰
Page 17
在酸性pH下，比较活泼的巯基和氨基，以带质子形式存在， 变成不活泼状态。
ICH2COO-+蛋白质—SH
ICH2COO-+蛋白质—SCH3 pH﹥7 pH﹥2
蛋白质—S —CH2COO-+H++ICH3
+H++I-
蛋白质—S —CH2COO-+I蛋白质—NH—CH2COO-+H++IN CH2COON
Page 19
⑤差别标记
在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋
白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将 过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与 含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制 剂保护的基团是带放射性同位素标记的。
⑥利用蛋白质状态的差异 在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。
疏水环境
阻止产物中电荷分离的反应 加速电荷中和的反应
反应类型⑴ 反应类型⑷
对于没有电荷分离和电荷只是从一个离子转移到另一个离 子的反应，则介质的极性不重要。
Page 13
4.1.3 修饰反应专一性的控制
（1）修饰试剂的选择 选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
Page 22
② 修饰残基的不稳定性 原始修饰以后，还可能发生共价改变。
如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫交换过程可能自 发地或在纯化、降解过程中发生。
③ 没有被发现的修饰
咪唑基、巯基、羧基等在反应条件下不稳定或在以后的 纯化中被水解，因而检测不出。
在酸性pH下，比较活泼的巯基和氨基，以带质子形式存在， 变成不活泼状态。
ICH2COO-+蛋白质—SH
ICH2COO-+蛋白质—SCH3 pH﹥7 pH﹥2
蛋白质—S —CH2COO-+H++ICH3
+H++I-
蛋白质—S —CH2COO-+I蛋白质—NH—CH2COO-+H++IN CH2COON
Page 19
⑤差别标记
在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋
白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将 过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与 含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制 剂保护的基团是带放射性同位素标记的。
⑥利用蛋白质状态的差异 在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。
疏水环境
阻止产物中电荷分离的反应 加速电荷中和的反应
反应类型⑴ 反应类型⑷
对于没有电荷分离和电荷只是从一个离子转移到另一个离 子的反应，则介质的极性不重要。
Page 13
4.1.3 修饰反应专一性的控制
（1）修饰试剂的选择 选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。
对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
Page 22
② 修饰残基的不稳定性 原始修饰以后，还可能发生共价改变。
如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫交换过程可能自 发地或在纯化、降解过程中发生。
③ 没有被发现的修饰
咪唑基、巯基、羧基等在反应条件下不稳定或在以后的 纯化中被水解，因而检测不出。
9蛋白质的化学修饰
可被光活化试剂.
间隔基团
同型双功能试剂 (CH2)n，长度可变 异型双功能试剂 （-S--（CH2）n-）2
OH O （ CH C ）2
亚氨酯
N S S
可被硫醇裂解 长度可变
Hale Waihona Puke 可被高碘酸裂解OH N3
N C
光活化双功能试剂
能与胺反 应的基团 能与巯基反 应的基团
C O N
O C Cl
CF3
（一）同型双功能试剂
由于这两种试剂 的结构与ATP相 似，才看作是内 生亲和试剂。
ATP的烷基卤化衍生物
二、外生亲和试剂 （一）将卤代烷基衍生物通过腺嘌呤的N-6连到腺嘌呤 上，则可形成有效的外生亲和试剂。
NH CH N N O P O CH2 O O O N N NH CO CH2Br
OH OH
N-6-对-溴乙酰胺-苄基-ADP
N ENZ
O N C OCH2CH3
焦碳酸二乙酯
CH3CH2OH +CO2
+
焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.
应注意 的问题
该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。 试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代 衍生物。
羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。
N ENZ
对氯硫硝基苯
带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单 一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质 可用来定量测定色氨酸。
七、酪氨酸酚基的修饰
四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可 电离的发色基团3-硝基酪氨酸。
ENZ CH
OH + C(NO2)4 四硝基甲烷
蛋白质分子的化学修饰
二、酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用
范围。（70年代末之后）
1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。
第三节 酶化学修饰的原理
凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价 结构发生改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水 解、分子内或分子间的交联），都可称为蛋白质的 化学修饰。
达到： • 改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对
效应物响应性能及对辅助因子的要求） • 提高酶的稳定性 • 扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
• 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基
团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
• 可作用基团：
• 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu ），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
蛋白质分子的化学 修饰
• 第一节 酶的活性中心 • 第二节 酶化学修饰的目的 • 第三节 酶化学修饰的原理 • 第四节 酶化学修饰的设计 • 第五节 酶化学修饰的应用 • 第六节 酶的蛋白质工程
第一节 酶的活性中心（active site）
一、活性中心的概念 ❖酶的必需基团(essential group):
活性部位是一个三维实体
二、活性中心的共性
(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用 等次级键结合。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
九、丝氨酸羟基的修饰
甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。
试剂
醋酸酐 酰基酸酐 醛 N-溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺 苯异硫氰 四硝基甲烷
三硝基苯磺酸
焦碳酸二乙酯 碘乙酸 环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟 马来酰胺
常用重要修饰剂的专一性
修饰的侧链
Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met
O
（三）可被光活化的试剂
N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫 代)丙酸酯
这类试剂是异型双功能试剂的扩展。
当交联剂一端的反应基团与蛋白质作用之后，经光照另一端则产 生一个反应活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。
这类交联剂一端一般含有能与氨基或巯基反应的基团，而另一端 则含有对光敏感的基团。
三、交联剂的使用
二、交联剂的类型
交联剂 类型
同型双功能试剂 异型双功能试剂 可被光活化试剂.
可裂解性 不可裂解性
反应基团
间隔基团
反应基团
CH3 O C NH2
亚氨酯
SS N
同型双功能试剂
(CH2)n，长度可变
异型双功能试剂
（-S--（CH2）n-）2
OHO （ CH C ）2
CH3 O C NH2
可被硫醇裂解 长度可变
（二）异型双功能试剂
这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二 亚胺时，另一端反应基团是羧基。
这类交联剂的一端含有氨基反应部分，N-羟琥珀酰亚胺，另一 端含有巯基反应部分，马来酰亚胺或联硫基。
O
O
(CH2)3 C O N
O
N-羟琥珀酰亚胺辛二酸酯 （非裂解）
2
O
O
S S (CH 2)2 CON N
蛋白质与交联剂的反应直接有助于蛋白质构象的稳定性
能形成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。 两种酶通过交联形成杂化酶。 交联可提高酶分子构象的稳定性。
交联剂可用来测定蛋白质亚基的量
可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。 测定蛋白质上残基间的距离。 测定酶的活性部位。
第五节 亲和标记
亲和标记：部位专一性标记，是利用酶和底物的亲和性， 使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸 残基进行共价标记。 亲和试剂作为底物类似物的标准：
OC
NHR
重排
O
ENZ C
O
NR C
+H+
NHR
E N ZC H
O H + C(NO2)4
四硝基甲烷
八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
ENZCH
OH
3-硝基酪氨酸 NO2
+ -C (N O 2)3+H +
用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸 烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。
吗啉型加合物
过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与赖氨酸侧链的可能反应
NH2
NH2
N
N
N
N
OO O
NN
O P O P O P O CH2 O
+ENZ-CH2SH
NN
RO CH2 O
OO
O H C C H 与巯基反应
OO
O-ATP
HO CH C H SO
CH2 ENZ
过碘酸氧化的ATP（O-ATP）与巯基侧链的可能反应
交联剂 同型双功能试剂 分为 异型双功能试剂
（二）交联距离
随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性 也随之增加。
（三）可裂解性
研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。
（四）反应活性部分
可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应 活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。
可被高碘酸裂解
OH N3
光活化双功能试剂
能与胺反 应的基团
CON
N CF3 C
（一）同型双功能试剂
能与巯基反 应的基团
O C Cl
交联剂两端具有相同的反应活性部分。
双亚氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是（CH2）n
N H 2C l N H 2C l 双亚氨酸酯（非裂解）
C H 3O C(C H 2)n CO C H 3
NH2
过碘酸氧化的ATP（O-ATP）
与氨基侧链的可能反应
NH2
N
N
N
N
O
NN
O P O CH2 O
O
OH OH
NH2
IO4-
OO O
NN
O P O P O P O CH2 O
OO
O
+ENZ-(CH2)4-NH2
与氨基反应
HC CH OO
O-ATP
NH2
N
N
N
N
NN RO CH2 O
NaBH4
NN RO CH2 O
H 2C C H 2 HN OH
(C H 2)4E N Z
HC CH
希夫碱化合物 N O
(C H 2)4E N Z
NH2
N
N
NH2
N
N
OO O
N
O P O P O P O CH2 O
N
+ENZ-(CH2)4-NH2 R O C H 2 N O N
OO
O
H C C H 与氨基反应
OO
O-ATP
HO N OH (C H 2)4EN Z
×
×
×
×
×
×
×
×
××
×
×
×××
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
×
第四节 蛋白质肽链的交联
双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨 基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间 的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。
一、设计或选择交联剂要考虑的因素 （一）反应的专一性
9蛋白质的化学修饰
三、羧基的修饰
用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧 基。
O ENZ C
O
NR
+ C + H+
+N HR
碳二亚胺
O
ENZ C
N + HR
OC
NHR
O
ENZ C
N + HR
OC
+ HX
NHR
O
N +HR
ENZ C X
+
OC
+H+
NHR
形成相应酰胺
OБайду номын сангаас
ENZ C
N + HR
1.在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；
2.亲和试剂的修饰程度是有限的； 3.没有反应性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反应速 度； 4.亲和试剂的体积不能太大，否则产生空间位阻；
5.修饰产物应当稳定，便于表征和定量。
亲和试 剂分类
内生亲和试剂 外生亲和试剂
一、内生亲和试剂
若间隔基团含有二硫桥，则成为可裂解同型双功能试剂。
N H 2 C l
N H 2 C l 二甲基-3，3′-二硫代-
C H 3O C ( C H 2 ) 2SS( C H 2 ) 2C O C H 3双丙基亚氨酯（可裂解）
所有同型双功能试剂都对氨基有专一性，但戊二醛例外，它 除了与氨基反应外，还可与羟基反应。
缺点：产生的二醛几乎全部与赖氨酸侧链反应，不能与 更多类型侧链反应。
嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和
侧链如Cys、His、Lys、Met等能与试剂上的卤原子反应。
OO O AdenCH 2 OPOPOPO H