合成生物学 ppt课件

（2）通过综合共转化 策略成功校正变体的 实例。 通过单个共转 化过程，用loxPsym 位点替换tRNA基因和 内含子;
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引入新序列
• 在每个非必需基因前后加入了特殊序列 – LoxP Sym sites
• 既能在酵母菌中复制也能在 大肠杆菌中复制，所谓酵母 菌—大肠杆菌穿梭载体。
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YAC载体
首先用EcoRI和BamHI双 酶切割Fra Baidu bibliotek获得均具 BamHI和EcoRI切割末端 的两个DNA片段(双臂) ，随后把两端具EcoRI 切割末端的外源DNA与 此双臂连接，构成酵母 人工染色体。用电激仪 把此人工染色体转化酵 母受体细胞。
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酿酒酵母作表达系统的缺点
v 在YAC载体中的插入片段会出现缺失和重排的 现象。
v 容易形成嵌合体。即在单个YAC中的插入片段 由2个或多个独立的基因片段连接组成的现象。
v YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近， YAC染色体转入酵母细胞后很难从中分离出来。
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人工合成酵母基因组
“Perfect” designer chromosome V and behavior of a ring derivative
EcoRI CEN4
列、克隆位点以及可在细菌 Apr 和酵母菌中选择的标记基因。
pYAC4
URA3
此外，YAC还具有酵母菌染 色体的一些特点。可以接受 ori
100-1000kb的外源DNA片段。
TEL BamHI TEL
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|这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制 形式进行高拷贝复制。 |这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化 第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制 的形式进行复制和传递。
Science Volume 355(6329):eaaf4704
March 10, 2017
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Synthetic Yeast 2.0
• Building the world‘s first synthetic eukaryotic genome together！
Dr. Jef Boeke
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YAC载体--pYAC4
• 主要结构：
①两个可在酵母菌中利用的选择基 因，URA3和TRP1(色氨酸合成基 因)；
②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)；
③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫
(Tetrahymenna thermophilp)的末端 重复序列(TEL)，以保持重组YAC 为线状结构；
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Isaacs, F. J. et al. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genomewide codon replacement. Science 333, 348–353 (2011).
（1）通过综合共转化 策略进行多重变异修 复
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⑤在两个末端序列中间，有 一段填充序列(HIS3)，以便 pYAC4在细菌细胞中稳定 扩增；
⑥Amp抗性及细菌质粒复制 原点；
⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该 位点位于酵母菌Sup4 tRNA 基因内。
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选择标记--Sup4
• Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成 为白色)。
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性 选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营 养缺陷型。
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人工酵母染色体克隆载体的构建
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建成功 的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记(HISA4和 TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322中，构建 成YCA克隆载体。
目录
u synV设计原理 u 人工设计基因组原则 u PCRTags u 引入新序列 u Cre-LoxP重组酶系统 u 组装
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synV设计原理
synV设计期间的主要编辑包括删除两个亚端粒区域，20个tRNA基因， 30个转座子/ Ty元件和10个内含子，并插入176个loxPsym位点; 额外的 基因变化包括62个TAG / TAA终止密码子互换和339个同义重新编码， 以引入源自天然染色体V的PCRTag
• 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的 菌落呈白色。
• 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已 经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色 菌落。
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• 一般酵母表达载体都以大肠 杆菌质粒为基本骨架再加上 酵母的自主复制序列，选择 标记，外源基因插入位点， 启动子和终止子。
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人工合成酵母染色体
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目录
u 酵母人工染色体载体 u 克隆载体的构建 u YAC载体详述 u 选择标记--Sup4 u 酿酒酵母作表达系统的缺点
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酵母人工染色体载体
酵母人工染色体(yeast
artificial chromosome，YAC) 是一类酵母穿梭载体。
YAC具有自主复制序
ARS1 TRP1
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酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) – 又称面包酵母或者出芽酵母 – 在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物 • Morganism – 发酵中最常用的生物种类。 – 细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。 – 同时存在单倍体和双倍体(酵母的优势形态)。
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人工设计基因组原则
删除
逆转录转座子
换位
Elements
替换
将TAG替换为TAA
引入
不变
Gene order
端粒重复部分 内含子
tRNA基因 部分同义密码子替换 LoxP Sym sites
PCRTags
Noncoding regions
• 利用密码子简并性实现
基本理念： 优化基因组，减少不稳定和冗余结构
合成生物学(Synthetic biology)
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1.人工合成酵母染色体 2.人工合成酵母基因组
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酿酒酵母简介
• 酵母（Yeast）是一类种类繁多的生物资源，已知 有80个属约600多种，数千个分离株。
• 酵母是一类单细胞的真核生物。 – 它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调 控机制。 – 它既能通过有丝分裂进行无性繁殖 – 也可以通过减数分裂实现有性繁殖。