二代测序流程
二代宏基因组测序数据标准分析流程
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二代dna测序技术数据的处理流程
二代dna测序技术数据的处理流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢!本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!二代DNA测序技术数据的处理流程引言DNA测序技术的发展为生物学、医学等领域带来了革命性的变化。
华大二代测序dnb制备流程
华大二代测序dnb制备流程首先，华大二代测序的dnb制备流程中，需要将DNA样品片段化。
首先需要准备待测DNA样品，对其进行适当处理，例如通过酶切将DNA分为较小片段，一般大小为200-500碱基对。
这样可以提高dnb制备效率，并减少错误率。
片段化的方法通常有使用限制性内切酶或超声波打碎。
其中，超声波法相对简单、快速，但酶切法则能够精确控制DNA片段大小。
在片段化之后，需要进一步将DNA片段与连接头引物连接。
连接的目的是为了提供适当的序列，以便在下一步PCR扩增过程中使用。
连接头引物是一种特殊的寡核苷酸序列，可以与DNA片段的末端序列相互结合。
连接头引物中还包含有用于二代测序起始转录的序列。
连接头引物的连接需要遵循一定的条件和步骤。
首先，需要选择适当的连接头引物，通常是由测序平台提供的一套标准连接头引物。
其次，在连接引物与DNA片段之间需要进行连接反应。
这个反应需要一定的温度和时间控制，以确保连接头引物与DNA片段稳定连接。
此外，还需要优化连接反应的浓度，以确保连接头引物与DNA片段的连接效率。
最后，连接头引物连接完成后，需要进行扩增板复性。
这一步骤是为了准备DNA片段在二代测序中的模板。
扩增板复性可以使用PCR技术进行。
在PCR反应中，连接头引物扮演着引物的角色，通过DNA酶在适当的温度下进行反应。
模板在PCR反应中被扩增，并复制成大量可供测序的DNA片段。
此外，PCR反应还可以通过引入荧光标记使DNA片段带有标识，便于后续测序分析。
总结来说，华大二代测序的dnb制备流程是将DNA样品片段化、连接头引物连接和扩增板复性的过程。
这些步骤关键是合理选择适用的片段化方法、连接头引物和PCR反应条件。
通过这些步骤的顺序进行，可以高效、准确地制备适用于华大二代测序的DNA模板。
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂的步骤和流程引言二代基因测序是一种高通量、高效率的基因测序技术，能够大规模地获取DNA或RNA的序列信息。
本文将详细描述二代基因测序的流程和试剂的步骤和流程，确保流程清晰且实用。
流程概述二代基因测序的流程可以分为样品准备、DNA或RNA提取、文库构建、聚合酶链式反应（PCR）、测序和数据分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作和试剂使用。
1. 样品准备样品准备是整个二代基因测序流程的关键步骤，合理的样品准备可以保证后续步骤的顺利进行。
样品可以是组织、细胞、血液等，需要根据研究目的进行选择。
样品准备的步骤包括：1.1 样品收集根据研究目的选择合适的样品，并采用合适的方法进行收集。
例如，对于组织样品，可以通过手术获取；对于细胞样品，可以通过培养或离心分离等方法获取。
1.2 样品保存采集后的样品需要及时保存，以防止样品质量的降低。
常用的保存方法包括冷冻保存和固定保存。
冷冻保存可以使用液氮保存或低温冰箱保存，固定保存可以使用甲醛等试剂进行固定。
2. DNA或RNA提取DNA或RNA提取是获取样品中的核酸的关键步骤，常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐酸法和商用试剂盒法等。
下面以商用试剂盒法为例进行介绍：2.1 样品裂解将样品加入裂解缓冲液中，通过离心等方法使细胞或组织破碎，释放出DNA或RNA。
2.2 蛋白酶处理加入蛋白酶将样品中的蛋白质降解，以便后续纯化DNA或RNA。
2.3 DNA或RNA纯化将裂解液加入商用试剂盒中，通过离心等方法将DNA或RNA与其他杂质分离。
根据试剂盒的不同，可以使用硅胶膜或磁珠等材料进行纯化。
2.4 洗脱DNA或RNA将纯化后的DNA或RNA从硅胶膜或磁珠上洗脱下来，得到纯化后的DNA或RNA。
3. 文库构建文库构建是将提取到的DNA或RNA转化为测序所需的文库，常用的文库构建方法包括PCR文库构建法和片段文库构建法。
下面以PCR文库构建法为例进行介绍：3.1 DNA片段制备将提取到的DNA通过限制性内切酶或超声波等方法制备成适当的片段。
二代测序实验方案和应用
这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。
随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。
这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：全基因组从头测序或者重测序目标序列重测序转录组分析微生物组研究基因调控研究NGS 序列二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。
从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。
台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。
这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。
目前，这些仪器的通量在10 Mb到 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。
高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。
一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。
与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。
还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。
因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。
有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。
这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。
这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。
DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：DNA样本制备文库构建和验证文库分子大规模平行克隆扩增测序二代测序DNA样本的质量控制首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。
二代测序概念
二代测序概念二代测序概念一、引言随着生物学研究的不断深入，对于DNA序列的解读和分析需求越来越大。
传统的Sanger测序技术虽然被广泛应用，但由于其低通量、高成本等缺点，不能满足现代生物学研究的需求。
因此，二代测序技术应运而生。
二、二代测序技术简介二代测序技术是指将DNA分子通过PCR扩增或文库构建等方法转化为大量的片段，并在高通量平台上进行并行测序。
与传统Sanger测序技术相比，二代测序技术具有高通量、高准确性、低成本等优势，因此被广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
三、二代测序技术原理1. PCR扩增法PCR扩增法是将DNA模板通过PCR反应扩增成短片段，并在高通量平台上进行并行测序。
PCR反应过程中需要引物和酶的参与，其中引物是指能够特异性结合到待扩增区域的两个小分子，酶则是指能够催化DNA链的合成。
2. 文库构建法文库构建法是将DNA分子通过酶切或化学方法转化为小片段，并将这些片段连接到适当的载体上，形成文库。
在高通量平台上进行并行测序时，需要将文库中的DNA片段解离，使其单独存在，并进行测序。
四、二代测序技术流程二代测序技术流程包括样品准备、DNA提取、文库构建或PCR扩增、高通量测序和数据分析等步骤。
其中，样品准备是指从生物体中提取出所需的组织或细胞；DNA提取是指将样品中的DNA分子提取出来；文库构建或PCR扩增是将DNA分子转化为小片段，并连接到载体上；高通量测序是对文库或PCR产物进行并行测序；数据分析则是对测序结果进行处理和分析。
五、二代测序技术应用二代测序技术已经广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
其中，基因组学研究主要关注染色体结构和功能；转录组学研究主要关注基因表达水平和调控机制；表观基因组学研究主要关注DNA甲基化和组蛋白修饰等影响基因表达的因素。
六、二代测序技术发展趋势随着二代测序技术的不断发展，其应用领域也在不断扩大。
未来，二代测序技术有望应用于个性化医疗、环境监测、食品安全等领域，为人类健康和社会发展做出更大的贡献。
二代测序建库试剂盒流程
二代测序建库试剂盒流程二代测序建库试剂盒提供了将DNA样品准备成测序文库所需的试剂和材料。
该流程通常包括以下步骤：1. DNA片段化DNA片段化是将高分子量DNA剪切成更小的片段。
这可以通过超声波、酶切或机械断裂等方法实现。
片段化后的DNA片段保留了原始样品的碱基序列信息。
2. 末端修复片段化后的DNA片段末端可能出现缺口或突起，需要进行末端修复以使其钝化。
末端修复酶将5'突出的末端修剪至平齐，并填充3'凹陷的末端，为后续连接接头创造平滑的末端。
3. 接头连接接头是短的寡核苷酸，可连接到DNA片段的两端。
接头通常包含测序引物结合位点和适于多重样品标记的条形码序列。
接头连接酶将接头连接到片段化的DNA，形成连接好的DNA分子。
4. 片段大小选择连接好的DNA分子大小各异。
片段大小选择步骤通过凝胶电泳或磁珠纯化等方法去除不需要的大小片段，保留目标大小范围内的片段。
5. PCR扩增片段大小选择后的DNA文库需要进行PCR扩增，以产生足够量的DNA用于测序。
扩增时使用接头序列作为引物，确保在扩增产物中包含测序所需的信息。
6. 文库纯化扩增后的文库包含扩增产物，以及未扩增的引物和dNTPs等杂质。
文库纯化步骤使用磁珠或柱式纯化方法去除这些杂质，得到高纯度的二代测序文库。
7. 定量和测序纯化的文库需要进行定量，以确定DNA浓度和摩尔数。
定量后，文库被稀释至合适的浓度进行测序。
注意：不同的二代测序平台可能需要特定的试剂盒和流程细节。
始终遵循试剂盒制造商提供的说明以获得最佳结果。
二代测序技术的原理与应用
SNP的应用
• 1.寻找致病基因
遗传疾病中已发现SNP的例子，如镰刀形细胞贫血症、晚期突 发 老年性痴呆等
• 2.诊断及预测致病风险 • 3.药物基因体学及新药的发现
临床治疗实践清楚地表明，药物的有效剂量有著极大的个体差 异，可以视为一种基因的表型
• 4.生物芯片快速检测
第二代测序技术的应用
• 基因组测序、重测序 • 突变体的定位 • 寻找SNP位点 • 全基因组甲基化测序 • 基因表达变化分析
在第二代中最高读长；比第 一代的测序通量大
样品制备较难；难于 处理重复和同种碱基 多聚区域；试剂冲洗 带来错误累积；仪器 昂贵
很高测序通量
仪器昂贵；用于数据 删节和分析的费用很 高
很高测序通量；在广为接受 的几种第二代平台中，所要 拼接出人类基因组的试剂成 本最低
测序运行时间长；读 长短，造成成本高， 数据分析困难和基因 组拼接困难；仪器昂 贵
• 高通量测序技术
大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了 高准确性
• 主流平台
Ilumina (Solexa, Hiseq); Roche 454; ABI(Solid)
二代测序捕获流程
二代测序捕获流程Title:二代测序捕获流程Title: Second-Generation Sequencing Capture Process在二代测序捕获流程中，首先需要对样本进行DNA提取，以获得高质量的DNA模板。
In the second-generation sequencing capture process, the first step is to extract DNA from the sample to obtain high-quality DNA templates.接着，通过特定的捕获探针针对目标区域进行富集，提高目标区域在文库中的比例。
ext, specific capture probes are used to enrich target regions, thereby increasing the proportion of target regions in the library.随后，对富集后的文库进行PCR扩增，以增加目标区域的测序深度。
After enrichment, PCR amplification is performed on the enriched library to increase the sequencing depth of the target region.最后，通过二代测序平台对扩增后的文库进行测序，得到目标区域的序列信息。
Finally, the amplified library is sequenced on a second-generation sequencing platform to obtain the sequence information of the target region.在整个流程中，需要注意操作的精确性和试剂的选择，以确保捕获效果和测序结果的准确性。
二代测序流程
二代测序流程
二代测序流程分为以下步骤：
1. 文库构建：将DNA样本进行处理，包括DNA提取、片段化、连接测序接头等步骤，生成文库。
2. 扩增：使用PCR等方法，扩增文库中的DNA片段，以提高其浓度。
3. 固定到测序芯片上：将扩增的DNA片段固定在测序芯片（如芯片上的微孔、特定区域）上。
4. 测序：利用测序仪器进行测序。
目前常用的测序技术包括Illumina公司的Illumina测序、Ion T orrent公司的Ion Torrent测序、PacBio公司的PacBio 测序等。
这些技术可以通过不同原理实现测序，如碱基配对法、硅芯片测序、真空吸附技术等。
5. 数据分析：将测序获得的原始数据进行存储和处理。
包括图像分析、碱基识别、比对和拼接等步骤。
最终得到序列的测序结果。
6. 结果解读：根据测序结果进行进一步分析和解读，如基因组拼接、变异检测、功能注释等。
需要注意的是，二代测序流程可以因具体测序技术的不同而有所差异。
此外，每个步骤中都包括一系列操作和检测，并需要使用特定设备和试剂来完成。
宏基因二代测序原理及流程
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简述二代测序边合成变测序技术原理及流程
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遗传病二代测序临床检测全流程规范化共识
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高通量测序流程和原理
高通量测序流程和原理
高通量测序（High-throughput sequencing）是一种快速、高效的DNA测序技术，也被称为第二代测序技术。
它的出现极大地推动了基因组学和生物信息学的发展，为基因组变异、表达调控、蛋白质组学等研究领域提供了强大的支持。
高通量测序的流程可以简单概括为DNA提取、文库构建、测序仪测序和数据分析四个步骤。
首先是DNA提取，从样本中提取出所需的DNA，可以是基因组DNA、表达物的cDNA等。
接下来是文库构建，将提取的DNA片段连接到测序引物上，形成文库。
然后是测序仪测序，将文库中的DNA片段进行高通量测序，得到大量的原始测序数据。
最后是数据分析，对原始数据进行质控、比对、组装和功能注释等一系列分析，最终得到所需的生物信息学结果。
高通量测序的原理主要基于测序引物的引导下，通过不断地合成和检测新的核苷酸碱基，从而逐渐构建起整个DNA片段的序列。
常见的高通量测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序等，它们各自采用不同的原理和方法，但都能实现高通量的DNA测序。
在实际应用中，高通量测序技术被广泛应用于基因组测序、转录组测序、表观基因组测序等领域。
它不仅在科学研究中发挥着重要作用，还在临床诊断、生物工程、农业育种等领域有着广阔的应用前景。
总之，高通量测序技术以其快速、高效、准确的特点，成为现代生物学研究中不可或缺的重要工具，为我们深入了解生命的奥秘提供了有力支持。
随着技术的不断进步和应用的不断拓展，相信高通量测序技术将为生命科学领域带来更多的惊喜和突破。
二代测序DNA剪切(核酸打断)流程及注意事项
4.仪器连续使用一小时后，保证仪器停止超声至少20分钟.此过程须保持冷循环机正常运作，超声仪电源开启的状态
5.仪器运作时不可突然关闭电源，如要关闭电源，必须先停止仪器运转之后才可关闭电源
3.DNA样本溶于1x TE buffer中，体积100ul，
DNA浓度：1~20ng/ul (10ng/ul最佳)
4.设定仪器超声时间(Time ON);暂停时间(Time Off);以及超声循环数(Cycles);厂家推荐循环参数如下表，在此基础上客户可自行调整
5.将样品管以对称形式放入适配器中，空的地方请补空管，空管中加入与样本一样体积的蒸馏水即可
6.按下超声仪启动按键，根据总循环数设定5~10个循环为一次，停机后取下样本vortex & spin down后继续第二次、第三次等
7.超声仪使用完毕后，请先关闭冷循环压缩机与电源，再关闭超声仪电源，并将适配器擦干后安全放置
使用安全注意事项
1.每周至少要换一次水(蒸馏水).不可使用去离子水.不可加入抗冻剂，杀藻剂等任何添加剂进入冷循环机
二代测序DNA剪切（核酸打断）流程及注意事项
使用仪器
核酸打断仪：Bioruptor pico（Diagenode）
振荡混匀器：SA8（Stuart）
迷你离心机：Multi Spin（Tomy）
DNA剪切（核酸打断）流程
1.将冷循环机中装满蒸馏水或纯净水或RO水.不可用去离子水
2.先开冷循环机电源以及压缩机开关，再将超声仪主电源打开，让水保持循环状态直到4度之后才可使用
6.每天必须关闭电源，不可让仪器运转过夜
7.仪器不可任意搬动，冷循环机不可置于桌上，必须放置于地面
文库流程(Illumina二代测序)
TruSeq DNA Sample Preparaton（Illumina）1.DNA shearing2ug DNA for sonication(100ul)5ul using for detectionConcentrate EB 50ul2.End repaira.Systemb.Program30℃,30minc.Clean upAdd 160ul well-mixed Agencourt AMPure XP Beads:seal with Microseal ‘B’adhesive seal,shake 1800rpm,2min RT 15minPlace on the magnetic stand at RT 15min or until the liquid appear clearRemove and discard 127.5ul of the supernatant,repeat once Add 200ul 80% EtOH, RT 30s,remove and discard the supernatant,repeat onceRT 15min,then remove the magnetic standResuspend the dried pellet with 17.5ul Resuspension Buffer ,MIX:seal ‘B’,shake 1800rpm 2minRT 2minPlace on the magnetic stand at RT for 5min or until the liquid appear clearTransfer 15ul the clear supernatant to the new MIDI plate labeled with ALP barcode.3.Adenylate 3’ endsa.Systemb.Program37℃,30minThen immediately to ligate adapter4.Ligate adaptersa.Systemb.Program30℃,10minThen add 5ul STOP ligation bufferc.Clean up1)Add 42.5ul beadsmix:seal with Microseal ‘B’adhesive seal,shake 1800rpm,2min RT 15minPlace on the magnetic stand at RT 5min or until the liquid appear clearRemove and discard 80ul of the supernatantAdd 200ul 80% EtOH, RT 30s,remove and discard the supernatant,repeat onceRT 15min,then remove the magnetic standResuspend the dried pellet with 52.5ul ResuspensionBuffer ,MIX:seal ‘B’,shake 1800rpm 2minRT 2minPlace on the magnetic stand at RT for 5min or until the liquid appear clearTransfer 50ul the clear supernatant to the new MIDI plate labeled with CAP barcode.2)Add 50ul beadsMix:seal with Microseal ‘B’adhesive seal,shake 1800rpm,2min RT 15minPlace on the magnetic stand at RT 5min or until the liquid appear clearRemove and discard 95ul of the supernatantAdd 200ul 80% EtOH, RT 30s,remove and discard the supernatant,repeat onceRT 15min,then remove the magnetic standResuspend the dried pellet with 22.5ul Resuspension Buffer ,MIX:seal ‘B’,shake 1800rpm 2minRT 2minPlace on the magnetic stand at RT for 5min or until the liquid appear clearTransfer 20ul the clear supernatant to the new MIDI plate labeled with SSP barcode.5.Pruify ligation productsa.2% agarose 120V 120minb. Cut the gel ,ranging in size from 400-500bpc. Incubate the gel in the QG solution at RT until completely dissolved, while vortexing every 2 minMinElute gel Extraction Kit25ul QIAGEN EBd.Transfer 20ul to new 0.3ml PCR plate labeled with PCR barcode6.Enrich DNA fragmentsa.Systemb.ProgramChoose the pre-heat lid option and set to 100℃c.Clean upAdd 50ul beads,using the DNA adapter tubes; Add 47.5ul beads,using DAP RT 15minPlace on the magnetic stand at RT for 5min or until the liquid appears clearRemove and discard 95ul supernatantAdd 200ul 80% EtOH, RT 30s, remove and discard the supernatant, repeat onceRT 15min,then remove the magnetic standResuspend the dried pellet with 32.5ul Resuspension Buffer ,MIX:seal ‘B’,shake 1800rpm 2minRT 2minPlace on the magnetic stand at RT for 5min or until the liquid appear clearTransfer 30ul the clear supernatant to the 0.3ml PCR plate labeled with TSP1 barcode.7.Validate library8.Normalize ang pool libraries。
赛默飞二代测序技术原理及流程
赛默飞二代测序技术原理及流程赛默飞二代测序技术（Next Generation Sequencing，简称NGS）是一种高通量、高效率的测序方法，可以快速且准确地测序DNA或RNA 样本。
The principle of the second-generation sequencing technology of Thermo Fisher is based on the synthesis of DNA strands by sequencing by synthesis (SBS) technology, which is a major breakthrough in the field of sequencing technology.赛默飞二代测序技术的原理是基于测序通过合成（SBS）技术合成DNA链，这是测序技术领域的一项重大突破。
During the NGS process, the DNA or RNA sample is fragmented into short pieces, and adapters are added to the ends of the fragments.在NGS过程中，DNA或RNA样本被分解成短片段，并在片段的末端添加适配器。
These fragments are then attached to a solid surface, such as a flow cell, where they can be amplified and sequenced in parallel.然后，这些片段被连接到固体表面，比如流动池，使它们可以并行进行扩增和测序。
The sequencing by synthesis process involves taking images of the flow cell as each nucleotide is added to the growing DNA strand.测序通过合成的过程涉及到在每个核苷酸添加到不断增长的DNA链时拍摄流动池的图像。
二代测序实验室审批流程
二代测序实验室审批流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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Illumina测序的化学原理
目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。
所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。
之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升
一些常用的基本概念介绍：
flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane
lane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位
reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条reads
bp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度
双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp
junction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction adapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能
primer：PCR中的引物
测序反应基本流程介绍：
1、建库
A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的）
B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端
C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A
D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列
E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求
建库示意图如下：
2、桥式PCR
A、将上述的DNA样品调整到合适的浓度后加入到flowcell中，从而序列的一端与flowcell 上面已经存在的短序列通过互补配对结合，如下图：图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater，分别对应序列之前加入的两种adpater
B、连接以后就可以正式开始桥式PCR了。
首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。
加入NaOH 强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱
C、加入缓冲液，使其反应环境变成中性，这时序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配
D、进行下一轮PCR，在PCR的过程中，序列弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍
E、如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫做cluster
3、测序
测序的过程反而简单了不少。
就是来一个primer，然后加入特殊处理过的A，T，C，G 四种碱基。
特殊的地方有两点，一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证每次只能够在序列上添加1个碱基；另一方面是，碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色
在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。
这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。
因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致
随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。
如此往复，就可以测出序列的内容
Illumina测序会有长度限制的原因：
1、测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。
通俗一点讲就是，比如一开始1个cluster 中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。
这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。
随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。
当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，50个绿色，这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成
2、测序过程中，使用的碱基是特殊处理的，有一个非常大的荧光基团修饰。
在使用DNA 聚合酶的时候，酶的状态也会受到底物的影响，越来越差。