二代测序简介
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第二代测序技术简介
公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服 务，为客户提供完美的科研平台 。
基因组 SNPs（包括芯片、massarray） 第二代大规模测序
自主仪器 试剂
恒温金属浴
梯度PCR仪 恒温振荡仪
自主研发
液体蛋白磁珠 SBI试剂
病毒包装
miRNA表达谱 蛋白组 血清多肽谱 2DE LC-MS（Shotgun法） 代谢组 NMR LC-MS
Random Pair-end
Immobilization of Fragment
Clonal Amplification
Surface, Bead Covalent or non-covalent
Emulsion PCR Colony/Cluster
Sequence Read and Assembly
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
Roche/454 Workflow
•
DNA Library Prep
– – – – – – DNA Fragment End repaired Asymetric Adaptors ligated (one biotinylated) Immobilized on streptavidin coated magnetic beads Denatured -> ss template DNA library Purified
Roche/454 Workflow
• Bead Deposition
– One amplified bead per microwell – Followed by enzyme beads and packing beads – Enzyme beads
• • Sulfurylase Luciferase
Large-scale and high-throughput Amplification on solid surface
Cluster generation (bridge or polony amplification ) Emulsion PCR (fragment on beads)
• 可以进行Pair－End测序研究；
功能强大的基因组分析工具
—Polonator G.007
Polonator系统是由Dr.
George Church和他的研究小 组发明，该系统使用了美国最
先进试剂处理和检测的部件 ，采用了最敏感的检测设备 ，现在已发展成为一个包含 多个基因组学应用领域的研 究平台，并且承担了美国 “Personal Genome Project”的个人基因组测序 任务。Polonator G.007最大的
连接反应测序：polonator连接反应的底物是 9碱基单链荧光探针混合物。探针的5’末端分别 标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种 颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照 碱基互补规则与单链DNA模板链配对，结合的 探针就提供了一个荧光检测信号，最终被
仪器识别。
Polonator G.007
Miniaturization through microfluidic Single molecule detection
测序技术目标
人类全基因组测序的目 标：1000美元/人
2008年预测5年内实现
2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组 Archon X大奖，奖金高达1000万美元。这项 大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到 100万美元的费用，完成100个人类基因组测 序的团队。附加条件是覆盖率不小于98%， 误差不大于1/100000 bp。
Sanger’s Method
Labeled primer (1) Sequence reactions (4) Sequence separations (4) Sequence read-out
1st-Generation Automated DNA Sequencer
Parallel runs on 96 capillaries on ABI 3700
Limitation of 1st Gen Sequencer
Throughput
Time-consuming separation of chainterminated fragments Hard to produce massively parallel system based electrophoretic separation
SOLiD – ABI/Agencourt
SBL with dual base encoding
POLONATOR —Danaher Motion
SBL with base encoding
Next-Gen Sequencing Workflow
Fragment Library Preparation
Pyrosequencing
Convert PPi to ATP
Use ATP to generate light
Remove (d)NTPs and excess ATP
Roche/454 Workflow
•
Image Acquisition
– – By CCD camera coupled to the picotiterplate Chemiluminescent intensity reflects number of nucleotide incorporated in each flow; used to determine homopolymer region Up to 100 cycles
3
Key Genomics Technologies
1975 - Southern DNA hybridization technique
1977 - Sanger’s chain-termination and Maxam、Gilbert’s chemical DNA sequencing methods 1980 - Automated in situ oligonucleotide synthesis instrument 1985 - Mullis’s discovery of PCR at Cetus
–
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
• 速度快，一个测序反应耗时10个 小时，获得100余万个读长和4-6亿 个碱基对。
• 测序读长最长，单个序列的读长更 长，平均可达到400-500个碱基左右
• 准确度高，读长超过400bp时，单 一读长的准确性可以超过99%； • 一致性好，测序结果一致性超过 99.99%；
优势在于开机运行成本低和 Linux 开放资源软件。
Polonator G.007 Workflow
配对末端文库制备：配对末端文库是将基因 组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然 后用Mme1酶切，使中间接头两端各有~30bp 的碱基，再加上两端的接头，形成文库。 乳液PCR：在微反应器中加入测序模板、 PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（ Emulsion PCR）。 微球富集和固定：PCR完成之后，变性模板 ，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠 。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经 过3’修饰，可以与玻片共价结合。
Image Processing
wk.baidu.com
Post-acq Processing
Chemiluminescen t event maped to well Flowgram generated for each well Base called
De novo sequencing Resequencing Amplicon variant analysis
数据量— 每次运行可以得到~10Gb的 高质量数据 运行时间— ~80小时 读长— 30bp×2，每次运行可以读取 1.2 ~1.3×109个磁珠 准确性— 超过99% 运行成本— 仅为目前二代测序系统运 行成本的60% 样品数/运行— 同时支持2 ×8道最多 16个样品测序
In situ sequencing by chain extension
Sequence by synthesis – DNA polymerase Sequence by ligation – DNA ligase
Massively parallel processing
Array of clusters, beads
1992 - Affymatrix (Fodor’s group) first gene-chip
1995 - ABI’s first automated DNA sequencer
2006 - 2nd generation DNA sequencer on market
2007 and beyond – Single molecule sequencing techniques
Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
Sequential Sequence Extension Reaction
Polymerase Ligase
2nd Generation Performance
GS 454 技术原理 单运数据产量 覆盖人基因组 平均读长（bp） 样品准备 运行时间 精确度 单次运行价格 聚合酶/焦磷酸酶 0.4～0.6Gb 0.2× 400 2天 10小时 99％ 7万元 SOLiD 连接酶 50Gb 17× 50 7天 8天 99.94％ 3.5万元 SOLEXA 聚合酶 20Gb 6× 100×2 9小时 9.5天 98.5％ 2.5万元 POLONATOR 连接酶 20G 17 × ~30×2 7天 1周 99% ~40% off
Emulsion Amplification Template DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead) Thermocyle to amplify (forward primer is biotinylated) Amplified beads enriched with streptavidin coated magnetic beads
Squenom质谱仪
SAI质谱仪
慢病毒
RNA干扰库
MALDI TOF/TOF MicroRNA研究
测序仪：Polonator G.007
干细胞研究
内容提纲
• • • 从Sanger法到新一代测序技术 第二代测序平台介绍 第二代测序技术应用
• 宏基因组学（Metagenomics） • 泛基因组学（Pangenomics）
Sequencing Cost
Sample handling Difficult to miniaturize
Need for Faster and Cheaper Sequencing Technology
Personal Genome Project
Trends in Next-Generation Sequencing
Pyrosequencing
– Packing beads help to keep
4 nucleotides sequentially flow in Incorporation of a nucleotide releases a pyrophosphate (PPi) Sufurylase convert PPi into ATP ATP hydrolized by luciferase using luciferin to produce light
陈竺，日本血吸虫基因组
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服 务，为客户提供完美的科研平台 。
基因组 SNPs（包括芯片、massarray） 第二代大规模测序
自主仪器 试剂
恒温金属浴
梯度PCR仪 恒温振荡仪
自主研发
液体蛋白磁珠 SBI试剂
病毒包装
miRNA表达谱 蛋白组 血清多肽谱 2DE LC-MS（Shotgun法） 代谢组 NMR LC-MS
Random Pair-end
Immobilization of Fragment
Clonal Amplification
Surface, Bead Covalent or non-covalent
Emulsion PCR Colony/Cluster
Sequence Read and Assembly
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
Roche/454 Workflow
•
DNA Library Prep
– – – – – – DNA Fragment End repaired Asymetric Adaptors ligated (one biotinylated) Immobilized on streptavidin coated magnetic beads Denatured -> ss template DNA library Purified
Roche/454 Workflow
• Bead Deposition
– One amplified bead per microwell – Followed by enzyme beads and packing beads – Enzyme beads
• • Sulfurylase Luciferase
Large-scale and high-throughput Amplification on solid surface
Cluster generation (bridge or polony amplification ) Emulsion PCR (fragment on beads)
• 可以进行Pair－End测序研究；
功能强大的基因组分析工具
—Polonator G.007
Polonator系统是由Dr.
George Church和他的研究小 组发明，该系统使用了美国最
先进试剂处理和检测的部件 ，采用了最敏感的检测设备 ，现在已发展成为一个包含 多个基因组学应用领域的研 究平台，并且承担了美国 “Personal Genome Project”的个人基因组测序 任务。Polonator G.007最大的
连接反应测序：polonator连接反应的底物是 9碱基单链荧光探针混合物。探针的5’末端分别 标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种 颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照 碱基互补规则与单链DNA模板链配对，结合的 探针就提供了一个荧光检测信号，最终被
仪器识别。
Polonator G.007
Miniaturization through microfluidic Single molecule detection
测序技术目标
人类全基因组测序的目 标：1000美元/人
2008年预测5年内实现
2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组 Archon X大奖，奖金高达1000万美元。这项 大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到 100万美元的费用，完成100个人类基因组测 序的团队。附加条件是覆盖率不小于98%， 误差不大于1/100000 bp。
Sanger’s Method
Labeled primer (1) Sequence reactions (4) Sequence separations (4) Sequence read-out
1st-Generation Automated DNA Sequencer
Parallel runs on 96 capillaries on ABI 3700
Limitation of 1st Gen Sequencer
Throughput
Time-consuming separation of chainterminated fragments Hard to produce massively parallel system based electrophoretic separation
SOLiD – ABI/Agencourt
SBL with dual base encoding
POLONATOR —Danaher Motion
SBL with base encoding
Next-Gen Sequencing Workflow
Fragment Library Preparation
Pyrosequencing
Convert PPi to ATP
Use ATP to generate light
Remove (d)NTPs and excess ATP
Roche/454 Workflow
•
Image Acquisition
– – By CCD camera coupled to the picotiterplate Chemiluminescent intensity reflects number of nucleotide incorporated in each flow; used to determine homopolymer region Up to 100 cycles
3
Key Genomics Technologies
1975 - Southern DNA hybridization technique
1977 - Sanger’s chain-termination and Maxam、Gilbert’s chemical DNA sequencing methods 1980 - Automated in situ oligonucleotide synthesis instrument 1985 - Mullis’s discovery of PCR at Cetus
–
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
• 速度快，一个测序反应耗时10个 小时，获得100余万个读长和4-6亿 个碱基对。
• 测序读长最长，单个序列的读长更 长，平均可达到400-500个碱基左右
• 准确度高，读长超过400bp时，单 一读长的准确性可以超过99%； • 一致性好，测序结果一致性超过 99.99%；
优势在于开机运行成本低和 Linux 开放资源软件。
Polonator G.007 Workflow
配对末端文库制备：配对末端文库是将基因 组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然 后用Mme1酶切，使中间接头两端各有~30bp 的碱基，再加上两端的接头，形成文库。 乳液PCR：在微反应器中加入测序模板、 PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（ Emulsion PCR）。 微球富集和固定：PCR完成之后，变性模板 ，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠 。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经 过3’修饰，可以与玻片共价结合。
Image Processing
wk.baidu.com
Post-acq Processing
Chemiluminescen t event maped to well Flowgram generated for each well Base called
De novo sequencing Resequencing Amplicon variant analysis
数据量— 每次运行可以得到~10Gb的 高质量数据 运行时间— ~80小时 读长— 30bp×2，每次运行可以读取 1.2 ~1.3×109个磁珠 准确性— 超过99% 运行成本— 仅为目前二代测序系统运 行成本的60% 样品数/运行— 同时支持2 ×8道最多 16个样品测序
In situ sequencing by chain extension
Sequence by synthesis – DNA polymerase Sequence by ligation – DNA ligase
Massively parallel processing
Array of clusters, beads
1992 - Affymatrix (Fodor’s group) first gene-chip
1995 - ABI’s first automated DNA sequencer
2006 - 2nd generation DNA sequencer on market
2007 and beyond – Single molecule sequencing techniques
Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
Sequential Sequence Extension Reaction
Polymerase Ligase
2nd Generation Performance
GS 454 技术原理 单运数据产量 覆盖人基因组 平均读长（bp） 样品准备 运行时间 精确度 单次运行价格 聚合酶/焦磷酸酶 0.4～0.6Gb 0.2× 400 2天 10小时 99％ 7万元 SOLiD 连接酶 50Gb 17× 50 7天 8天 99.94％ 3.5万元 SOLEXA 聚合酶 20Gb 6× 100×2 9小时 9.5天 98.5％ 2.5万元 POLONATOR 连接酶 20G 17 × ~30×2 7天 1周 99% ~40% off
Emulsion Amplification Template DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead) Thermocyle to amplify (forward primer is biotinylated) Amplified beads enriched with streptavidin coated magnetic beads
Squenom质谱仪
SAI质谱仪
慢病毒
RNA干扰库
MALDI TOF/TOF MicroRNA研究
测序仪：Polonator G.007
干细胞研究
内容提纲
• • • 从Sanger法到新一代测序技术 第二代测序平台介绍 第二代测序技术应用
• 宏基因组学（Metagenomics） • 泛基因组学（Pangenomics）
Sequencing Cost
Sample handling Difficult to miniaturize
Need for Faster and Cheaper Sequencing Technology
Personal Genome Project
Trends in Next-Generation Sequencing
Pyrosequencing
– Packing beads help to keep
4 nucleotides sequentially flow in Incorporation of a nucleotide releases a pyrophosphate (PPi) Sufurylase convert PPi into ATP ATP hydrolized by luciferase using luciferin to produce light
陈竺，日本血吸虫基因组
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing