二三代测序技术的介绍和比较
二三代测序技术的介绍和比较
二三代测序技术的介绍和比较二代测序技术（也称为高通量测序技术）和三代测序技术是目前最常用的两种DNA测序技术。
下面将对这两种技术进行详细介绍和比较。
1.二代测序技术：二代测序技术的代表性平台包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM 等。
其工作原理是将DNA样本切割为较短的片段，并通过PCR扩增产生大量的拷贝。
然后，这些片段被连接在测序芯片上，每个片段都被反复地鸟嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘧啶（G）四种碱基中的一种互补的碱基识读，并记录下与之相对应的碱基序列。
这些碱基序列最后被计算机软件组装为完整的DNA序列，进而获取样本的遗传信息。
优点：（1）高通量：可以同时测序数百万个DNA片段，获得庞大数量的数据。
（2）成本低廉：通过并行测序的方式，可以大大减少测序成本。
（3）高精度：二代测序技术的错误率较低，可以达到0.1%以下。
（4）测序速度快：每天可获得几百GB的数据。
缺点：（1）仅适用于短序列：由于二代测序技术的局限性，只能测序相对较短的DNA片段，对于长序列的测序存在困难。
（2）高度依赖参考序列：在组装过程中，需要有可靠的参考序列作为基础，否则可能出现组装错误。
（3）无法解析复杂的基因组结构：由于只能产生相对较短的序列片段，二代测序技术无法很好地解析复杂的基因结构，例如重复序列。
2.三代测序技术：三代测序技术的代表性平台包括PacBio SMRT、Oxford Nanopore等。
三代测序技术的特点是可以直接测量DNA单分子的临床序列。
该技术中的样本DNA被引入到小孔中，随后测序设备会通过测量DNA分子在小孔中的电信号变化来捕捉和记录碱基序列。
这种技术可以完整地获取较长的DNA片段，从而提供了更全面和准确的基因组信息。
优点：（1）长读长：能够测序较长的DNA片段，可以获得更全面和准确的基因组信息。
（2）无需参考序列：三代测序技术不需要依赖已知的参考序列，可以直接解析未知基因组。
一代、二代、三代测序技术
三代基因组测序技术原理简介摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
简述基因一代、二代和三代测序技术原理及其应用范围
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义2. 基因测序技术的发展历程3. 基因测序技术的分类及特点4. 基因测序技术的应用范围二、基因测序技术原理及方法1. 基因一代测序技术原理及方法2. 基因二代测序技术原理及方法3. 基因三代测序技术原理及方法三、基因测序技术在生物研究中的应用1. 基因一代测序技术在生物研究中的应用2. 基因二代测序技术在生物研究中的应用3. 基因三代测序技术在生物研究中的应用四、基因测序技术在医学诊断与治疗中的应用1. 基因一代测序技术在医学诊断与治疗中的应用2. 基因二代测序技术在医学诊断与治疗中的应用3. 基因三代测序技术在医学诊断与治疗中的应用五、基因测序技术的发展趋势和展望1. 基因测序技术的发展趋势2. 基因测序技术的未来展望六、结语在人类基因组项目完成后，基因测序技术得到了长足的发展。
基因测序技术已经成为现代生物医学研究的重要工具，其在生物学研究、医学诊断与治疗等领域发挥着重要作用。
基因测序技术主要分为一代、二代和三代测序技术。
本文将对这三种基因测序技术的原理、应用范围等进行详细阐述，旨在全面了解基因测序技术的发展和应用。
一、基因测序技术的发展1. 基因测序技术的概念及意义基因测序技术是指通过化学或物理方法对DNA序列进行测定，进而推导出蛋白质的氨基酸序列的技术。
基因测序技术的发展对于了解生命活动、疾病的发生机制、药物研发等方面具有重要意义。
2. 基因测序技术的发展历程基因测序技术的发展经历了多个阶段，自20世纪末以来，随着技术的不断进步和成本的降低，基因测序技术得到了迅速发展和广泛应用。
3. 基因测序技术的分类及特点基因测序技术可以分为一代、二代和三代测序技术。
一代测序技术具有测序长度长、费用高、速度慢等特点；二代测序技术具有高通量、快速、低成本等特点；三代测序技术具有单分子测序、实时测序等特点。
4. 基因测序技术的应用范围基因测序技术在领域广泛，如生物学研究、医学诊断与治疗、个性化医疗、药物研发等领域都有重要应用。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
二代和三代测序原理及技术详解
二代和三代测序原理及技术详解二代测序（Second Generation Sequencing）和三代测序（Third Generation Sequencing）是现代生物学中常用的两种高通量测序技术。
二代测序技术主要包括Illumina测序技术和Ion Torrent测序技术，而三代测序技术则由PacBio和Oxford Nanopore等公司开发。
本文将详细介绍二代和三代测序的原理和技术。
二代测序技术采用了不同的原理，但其基本步骤相似。
首先，DNA 或RNA样本需要经过一系列的前处理步骤，如DNA片段化、连接测序指示子、PCR扩增等。
然后，将样品片段化的DNA或RNA分子固定到测序平台上，通过荧光标记的碱基依次加入到模板上，并经过图像采集系统进行扫描和记录。
最后，根据荧光信号的强度和位置确定每个碱基的序列，并通过计算机算法进行基因组的重建和分析。
Illumina测序技术是目前应用最广泛的二代测序技术之一。
其基本原理是通过将DNA片段固定到测序芯片上的特定位置上，然后通过反复的循环扩增和碱基加入的方式进行测序。
在每个循环中，只能加入一种荧光标记的碱基，并记录荧光信号，之后通过去除荧光信号并进行图像分析来确定碱基的序列。
Illumina测序技术具有高通量、高准确性和较低的测序成本，并广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域。
Ion Torrent测序技术是另一种常用的二代测序技术。
其原理基于DNA聚合酶催化链延伸反应，该反应会释放出质子，通过测量质子释放的情况来确定碱基的序列。
Ion T orrent测序技术具有高通量和较低的测序成本，但由于其测序误差率较高，主要应用于低复杂度的基因组测序和个体检测等领域。
与二代测序技术相比，三代测序技术具有更长的读长和更高的速度。
PacBio是其中一种代表性的三代测序技术。
PacBio测序技术基于单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing）原理，通过将DNA聚合酶与荧光标记的碱基一起加入到DNA模板上，通过测量聚合酶引发的荧光信号来确定碱基的序列。
一、二、三代测序技术
一代、二代、三代测序技术第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
一代-二代-三代测序原理
• 化学试剂三羧基乙基膦（TCEP）淬灭荧光信号；有时荧光基团切割不完全给簇形成荧光背景，导致测序够长。 • 叠氮保护基团遇到巯基试剂(如二巯基丙醇)会发生断裂，并在原来的位置形成羟基，供下一个碱基合上。
一代测序
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几 十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依 然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况 下成本太高，难以广泛应用。
三代测序
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序， 并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小 的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅 地降低了背景荧光干扰。
优势3 ：高准确率
SMRT 测序优势
三代测序
SMRT 测序优势
优势4 ：实时检测碱基修饰信息
三代测序
三代测序
三代测序
SMRT 测序建库
三代测序
Thank you for time
流动槽加入引物 Rd2 SP、DNA 聚合酶、荧光标 记的dNTP，对 第二条链测序。
三代测序技术发展及其他
三代测序技术发展及其他三代测序技术是指相对于第二代测序技术而言的新一代测序技术，它的出现使得基因组学研究进入了一个全新的阶段。
第一个商业化的第三代测序仪器是由Pacific Biosciences公司于2024年推出的PacBio RS平台。
随后，Oxford Nanopore Technologies公司于2024年推出的MinION也成为了第三代测序技术的代表。
相比于第二代测序技术，第三代测序技术具有以下几个显著的特点：1. 高通量：第三代测序技术具有较高的通量，有效地提高了测序效率。
例如，PacBio RS平台和MinION平台可以实时进行测序，并且可以同时对多个样本进行测序，大大缩短了测序时间。
2.长读长：相对于第二代测序技术产生的短读长，第三代测序技术可以产生长度更长的读长，从而更好地解决了连续序列的组装难题。
3.直接检测：第三代测序技术采用了不同的检测原理，如单分子扩增、单分子测序等，不需要PCR扩增或合成反应，减少了杂交、扩增等步骤，提高了测序准确性。
4.应用领域广泛：第三代测序技术广泛应用于基因组学、转录组学、蛋白质组学等领域，并在基因组重组、CNV检测、基因差异表达等研究中发挥了重要作用。
尽管第三代测序技术在许多方面都有显著的优势，但也存在一些挑战和限制。
例如，第三代测序技术产生的错误率较高，需要较高的测序深度来保证结果的准确性。
此外，第三代测序技术的设备和试剂成本较高，限制了其在一些实验室中的应用。
除了第三代测序技术，还有许多其他的测序技术也得到了广泛的应用，例如基于荧光标记的第二代测序技术（如Illumina平台）、长读长的第二代测序技术（如PacBio SMRT平台）等。
这些技术在测序效率、准确性和读长等方面都有不同的优势和局限性，因此在实际应用中，研究人员通常会根据研究目的和实验条件选择合适的测序技术。
总之，随着科学技术的不断发展，测序技术也在不断进步，三代测序技术成为了基因组学研究的重要工具之一、通过不断探索和创新，相信测序技术会不断发展，为基因组学和生物学领域的研究提供更多有价值的数据。
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一、初现庐山真面目——一代测序：又称Sanger测序（多分子，单克隆）历史：第一代DNA测序技术（又称Sanger测序）在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长5375个碱基。
研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进（如使用了不同策略的作图法、鸟枪法），2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
二、江山辈有人才出——二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。
经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。
1、Illumina 原理：桥式PCR 4色荧光可逆终止激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DNA片段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。
而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。
2、Roche 454油包水PCR 4种dNTP车轮大战检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油独立PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。
DNA测序技术的进展及其在生命科学中的应用
DNA测序技术的进展及其在生命科学中的应用DNA测序技术是指对DNA分子进行核苷酸序列的测定和分析的技术。
随着科技的不断进步，DNA测序技术也不断更新，目前，第三代测序技术已经成为主流，而第四代测序技术正在快速发展。
本文主要介绍DNA测序技术的进展及其在生命科学中的应用。
一、第一代DNA测序技术第一代DNA测序技术是指使用Sanger测序技术对DNA进行测序。
Sanger测序技术是以DNA聚合酶为基础，通过富集、扩增、定点位点标记技术，从而进行DNA测序。
Sanger测序技术不仅能够快速、准确地测序DNA，还可以在生命科学研究中应用于各种领域，比如基因表达分析、单核苷酸多态性研究等，因此在生命科学研究中被广泛应用。
二、第二代DNA测序技术第二代测序技术在Sanger测序技术基础上进行了改进，通过构建并行测序平台，实现了大规模的高通量测序。
目前比较常用的第二代测序技术有Illumina、ABI SOLiD和Roche 454等。
相比于第一代测序技术，第二代测序技术明显提高了测序速度和检测效率，而且测序成本也大幅降低，因此被广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等多个生命科学领域。
三、第三代DNA测序技术第三代测序技术采用的是单分子测序技术，其代表性产品是Pacific Biosciences（PacBio）公司的PacBio RS II系统和OXFORD Nanopore公司的MinION系统。
这些技术可以直接对DNA分子进行测序，不需要像第二代测序技术那样通过PCR扩增，因此可以实现测序的实时跟踪和单分子检测。
第三代测序技术具有高精度、低重复性、长读长优势，另外，它还支持直接检测了草图、异质体、基因重复、基因捆绑、病毒等长读长的表达，可以更精确地对以上问题进行分析。
因此，在如基因编辑和癌症诊断、药物筛选和婴儿基因疾病检测等方面有自己的应用。
四、DNA测序在生命科学中的应用1. 基因组研究DNA测序技术在基因组研究中有着非常重要的应用。
三代测序技术的应用以及与二代技术的比较
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测）【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30X达到Q50
通常Q30
通量
一个run(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。
三代测序应用范围
全长转录组
全基因组De novo
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组做表达鉴定（可以检测低丰度、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本
简单粗暴的讲解所谓的一代，二代，三代测序技术
简单粗暴的讲解所谓的一代，二代，三代测序技术在日常的科研中我们时不时的会听到小伙伴们在讨论那些关于测序的东西，什么高通量测序，二代测序，Sanger测序等等。
今天我们就用最简单的言语来讲解一下这三种测序技术。
一代测序技术，也被称为Sanger测序，其实是由一个叫Sanger 的人发明的一种测序方式。
其利用了双脱氧核苷酸会终止PCR的原理。
比如：一条序列为ATCGCTA，我们进行3次的双脱氧核苷酸，第一次加入双脱氧核苷酸A和正常的ATCG那么我们会得到下面两种序列，A、ATCGCTA。
那么我们就知道碱基A在序列的第一个碱基和第7个碱基。
同理运用双氧核苷酸T和C，就会得整个序列的对应碱基的位置BP信息。
进而得到整条序列的ATCG的序列信息。
当然这些都是由仪器进行检测的。
一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。
所以被广泛应用在单序列测序上。
简单概括就是，一代测序只能测一条长度在1000bp左右的序列。
二代测序技术，也被称为高通量测序技术。
它解决了一代测序只能测一条序列的缺陷。
随着科研的不断深入，我们开始分析一个物种或样本中的所有序列信息，这个时候一代测序一次测一条的方式就无法满足我们的需求。
二代测序技术就是在这样的情况下诞生的。
之所以称其为高通量测序就是因为它一次能够同时测很多的序列。
我们通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库（这里就不深入建库的原理了）富集了这些DNA片段。
接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。
最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。
二代测序特点：一次能够测大量的序列，但是片段被限制在了250-300bp，由于是通过序列的重叠区域进行拼接，所以有些序列可能被测了好多次。
二三代测序技术的介绍和比较
目录
I. 测序技术发展 II. 二代测序 III. 三代测序 IV. 应用
二代和三代测序技术的比较
测序技术发展
1925
DNA是 遗传物
质
1953
DNA双 螺旋
1966
遗传密 码
1977
化学降解 和
Sanger 测序
1986
第一台 自动测 序仪
1998
第一台 全自动 测序仪 3700
二代和三代测序技术的比较
三代测序—Ion Torrent
Ion Torrent是一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术。
基本特 原点 理
当➢ D不N需A要聚昂合贵酶的把物核理苷成酸像聚等合设到备延，伸成 中的本D相N对A较链低上，时体，积会小释，放操出作一简个单氢； 离➢ 子快，速反，应除池了中2天的文PH库发制生作改时变间，，位整 于池个下上的机离测子序感可受在器2-感3.受5小到时H内+离完子成； 信➢ 号不，过H整+个离芯子片信的号通再量直并接不转高化，为目数前 字信是号10，G从左而右读，出适D合N小A基序因列组。和外显
因组的试剂成本最低
困难；仪器昂贵
太平洋生物科 学公司
PacBio
SMRT
实时单分子DNA测 序
荧光/光学
~1000
并不能高效地将DNA聚合酶加到
高平均读长，比第一代的测序时间 测序阵列中；准确性一次性达标的
降低；不需要扩增；最长单个读长 机会低（81-83%）；DNA聚合酶
接近3000碱基
在阵列中降解；总体上每个碱基测
2005
2006
Roche4 54
Illumin a
Solexa GA测序
一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用
备注：数据来源于罗氏官网和网络
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
ABI/SOLiD技术原理： SOLiD测序技术也是采用油包水的方式进行Emulsion PCR。
不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多， 只有1μm大小，用连接酶替代了常用的DNA聚合酶。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
① Ion Torrent测序芯片，是一块半导体芯片； ② 孔即是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。 ③ 4种dNTP依次流过Ion芯片； ④ 发生聚合反应产生H+引起PH变化，被传感器记录下来。 每个碱基的检测只需要几秒钟。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
读长
2x150bp 2x150bp 2x300bp
台式测序 2x150bp
台式测序/大规 模
2x150bp
大规模 测序
2x250bp
大规模 测序
2x150bp
测序通量 1.2Gb 7.5Gb
15Gb
120Gb
330Gb
6000Gb
16Tb
最大reads数 4M
25M
25M+
运行时间 9.5-19h 4-24h
4-55h
400M 12-30h
1.1B+ 11-48h
200亿 13-44h
260亿（单） 520亿（双）
13-48h
二代测序的技术平台——华大智造
华大基因先推出了BGISEQ-500桌面化测序系统， 之后又推出： BGISEQ-50、 MGISEQ-200、 MGISEQ-2000均取得了NMPA（原CFDA）认证， 还推出了MGISEQ-T7， 2022年10月推出DNBSEQ-T10x4、DNBSEQ-T7高通量测 序仪。
基因测序的前世今生（一代测序,二代测序,三代测序最详原理）
测序技术的前世今生测序技术的发展历程第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。
1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：步：1）构建DNA测序文库测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。
2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2镜头课捕获荧光信号。
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一代测序、二代测序和三代测序是现代生物学领域中常用的测序技术，它们在测序速度、读长、准确度和成本等方面具有不同的优缺点。
下面将分别对这三种测序技术进行详细的优缺点及应用对比。
一代测序，也称为Sanger测序，是最早的高通量测序技术。
该技术基于DNA聚合酶合成双链DNA的特性，通过添加并特异性终止DNA合成的二进制链终止反应（dideoxynucleotides），将合成停止的DNA片段进行电泳分离，最终形成读取序列。
一代测序的主要优点是高准确度，错误率低于0.1%。
然而，其主要缺点是低通量和昂贵的费用，每天只能测序几十到几百个碱基对，且测序成本较高。
由于这些局限性，一代测序在特定应用领域中仍具有重要作用，如对单个基因的测定和疾病相关突变的鉴定。
二代测序是目前最常用的高通量测序技术，代表性的有illumina公司的测序平台。
该技术采用大规模并行测序的方法，将DNA片段固定在微米级反应区域中，通过构建DNA文库、聚合酶链式反应和定向插入测序等步骤，实现对DNA片段的扩增和测序。
二代测序的优点是高通量、高准确度和较短的读长，可以快速地获得数以Gb计的测序结果。
然而，该技术的主要缺点是较短的读长，通常在几百个碱基对左右，这限制了其在一些应用中的使用。
此外，二代测序还容易出现序列偏差和较高的错误率。
尽管如此，二代测序仍广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学和微生物学等研究领域。
三代测序，也被称为单分子测序，是近年来发展起来的一种新技术。
代表性的平台有PacBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）。
三代测序与一二代测序的不同之处在于，它可以直接测序一个单一的分子而无需扩增，同时可以获得更长的读长。
这是通过监测DNA分子在单个酶链中的碱基与探测器相互作用的方式实现的。
三代测序的主要优势是长读长，可以从几千到几十万个碱基对不等。
一代、二代、三代测序技术原理与比较
一代、二代、三代测序技术原理与比较【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。
摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA 双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP 的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
新一代基因测序技术的比较及应用
新一代基因测序技术的比较及应用介绍在过去的几十年里，基因测序技术已经取得了显著的进展。
随着新一代基因测序技术的发展，数据处理能力和测序精度都得到了显著提高。
本文将比较几种新一代基因测序技术，并探讨它们在不同领域中的应用。
比较1. 二代测序技术二代测序技术是当前最常见的基因测序技术。
它使用DNA polymerase合成DNA链，并标记加入不同的核苷酸，以便识别核苷酸序列。
二代测序技术具有高通量、快速、低成本的特点，适用于大规模测序。
与Sanger测序相比，二代测序技术的灵敏度和分辨率更高，并且克服了Sanger技术在读取较长的DNA段时的限制。
但是，由于二代测序技术不能准确地读取长链DNA，因此在组装长链基因组序列时存在一定难度。
2. 第三代测序技术第三代测序技术与二代测序技术相比，在读取长链DNA方面具有更高的准确性和可靠性。
第三代测序技术使用单分子荧光和纳米孔电子传导技术读取DNA序列，并且能够无需PCR扩增进行测序，从而避免测序过程中的错误累积。
第三代测序技术的优点之一是可以直接读取RNA序列，并导出全长转录本，这是现有测序技术无法实现的。
3. 比较第三代测序技术相对于二代测序技术具有更高的精度和准确性，但其通量和读取长度限制仍然存在，这意味着目前的第三代测序技术应用范围仍然比较有限。
应用1. 个性化医疗基因测序技术可以鉴定患者体内的不同基因序列及其变异，从而为疾病预测和治疗提供指导，以实现个性化医疗。
通过对个体基因组的测序和分析，如基因组学研究、代谢组学研究以及微生物组学研究等领域，提高人类疾病的诊断和治疗效果，使医疗变得更加个性化和精准化。
2. 农业基因测序技术在农业领域的应用也越来越广泛。
例如，基因测序技术可以用来研究植物和动物基因组，开发新型高产、抗病、抗旱、抗虫等新品种或育种技术，以提高农业生产力和经济效益。
3. 生态生态学研究可以证明不同群体、样品，甚至整个生态系统之间的生物多样性和相互作用。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
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20 billion 2 × 150 bp Lower Cost Higher Cost
二代和三代测序技术的比较
Illumina测序仪的选择
二代和三代测序技术的比较
二代测序—Roche 454
Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。
二代和三代测序技术的比较
二代测序— Solid
二代和三代测序技术的比较
Ion Torrent—short reads
二代和三代测序技术的比较
Ion Torrent—long reads
二代和三代测序技术的比较
Ion Torrent 主要应用
靶向测序 转录组测序 异倍性和 CNV 分析 小分子 RNA 和 miRNA 测序 病毒分型 外显子组测序 微生物测序 通过测序进行基因分型 De Novo 从头测序
2. PacBio /SMRT
3. Oxford / Nanopore
4. Thermo / Ion Torrent
二代和三代测序技术的比较
三代测序—SMRT
• PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体。 • 4色荧光标记 4 种碱基，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。 • 通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，可以通过这个来之间检 测甲基化等信息。 • SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。 • DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一。 • 测序错误率比较高，通过多次测序纠错。
太平洋生物科 PacBio SMRT 学公司
实时单分子DNA测 荧光/光学 序
~1000
第三代
Ion Torrent/生 PGM 命技术公司
合成测序法
以离子敏感场效应 晶体管检测pH值变 100-200 化
牛津纳米孔公 gridION 司
纳米孔外切酶测序 电流
尚未定量
二代和三代测序技术的比较
有潜力达到高读长；可以成本生产 切断的核苷酸可能被读错方向；难 纳米孔；无需荧光标记或光学手段 于生产出带多重平行孔的装置
以及不稳定的微卫星标志物的完整序列；
• 靶向检测基因或大型基因组的特定区域，直接检测其变异，揭示耐药机制； • 更完整的测序帮助还原更全面的免疫反应原貌。
二代和三代测序技术的比较
三代测序—研究热点
基因组组装（2+3）
微生物16S分析
算法开发
二代和三代测序技术的比较
二代测序技术的比较
公司 平台名称 测序方法 检测方法 大约读长(碱 优点 基数) 相对局限性 样品制备较难；难于处理重复和同 在第二代中最高读长；比第一代的 种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错 测序通量大 误累积；仪器昂贵 很高测序通量 仪器昂贵；用于数据删节和分析的 费用很高
Pathogenic germline variants（MutSigCV） Copy number analyses
Intra-tumour heterogeneity
Nature communications, 2016, Breast cancer
二代和三代测序技术的比较
三代测序
1. 单分子测序
细菌分型
二代和三代测序技术的比较
三代测序技术应用
全基因组测序
从整体上以单碱基对分辨率检测结构
变异。 更高质的人类基因组全新组装；
靶向捕获测序
表征人类遗传疾病的复杂区域；
解决微生物和传染病研究中的复杂区域；
获得全长HLA等位基因变异而无插补； 表征复杂免疫区域的扩增单体型； 直接检测转录本的全长，消除了使用算法 对转录本进行重建的步骤
的方法，它的测③ 桥式PCR扩增与变性 ④ 测序
二代和三代测序技术的比较
Illumina测序仪比较
NextSeq 系列 HiSeq 系列 HiSeq X 系列 NovaSeq 系列
最大输出
运行时间
120 Gb
12-30 hr
1500 Gb <1–3.5 days（Hiseq 3000/4000） 7hr-6days (Hiseq 2500)
Survival analyses
Variant calling （SNV filtering，Indel filtering）
Driver gene identification ensure hotspots variants with low VAF (2-10%)
Clonal states of Mutdriver mutations
肿瘤发生发展机理 肿瘤分子标记物 肿瘤分子分型 肿瘤病理关联
遗传性肿瘤家系 队列研究
二代和三代测序技术的比较
队列分析—案例
Alignment and quality assessment Assess the sensitivity and specificity of variant calls
SOLiD使用连接法测序，基于“双碱基编码原理”获得SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编 码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量 引物reset
二代和三代测序技术 的介绍与比较
目 录
I.
II.
测序技术发展
二代测序
III. 三代测序 IV. 应用
二代和三代测序技术的比较
测序技术发展
2015
2012 2010
2008
2007 1998 1977 1966 1953 1925 DNA是 遗传物 质 DNA双 螺旋 遗传密 码 化学降解 和 Sanger 测序 第一台 自动测 序仪 1986 第一台 全自动 测序仪 3700 Illumin a Solexa GA测序 仪 ABI Solid System 2005 2006 Illumina HiSeq 系列 第一台 SMRT 测序仪 PacBio RS Ion Torrent 半导体 测序仪 PGM 第一台 基于 Nanop ore技术 的 MinION 和 GridIO N测序 仪
Beads固定
ECC
二代和三代测序技术的比较
二代测序— Solid
二代和三代测序技术的比较
二代测序—分析流程
Germline
二代和三代测序技术的比较
二代测序—分析流程
Somatic
二代和三代测序技术的比较
二代测序—临床应用
临床应用
在肿瘤临床中的应用优势
对比项 大片段检测 突变检测 检测灵敏度 传统方法 FISH Sanger 检测单 个基因 高通量测序 不受邻近片段 的影响 同时检测多基 因
Roche4 54
第一台单 分子测序 仪 Helisco pe
BGISE Q 500
人基因 组 2000
二代和三代测序技术的比较
测序成本
二代和三代测序技术的比较
二代测序技术
Illumina
ABI SOLID
Roche 454
二代和三代测序技术的比较
二代测序技术— Illumina
Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的机器采用的都是边合成边测序
THANK YOU
生育健康
癌症 遗传病
用药指导
传染病 移植分型
Sanger 15-20% 可以达到0.5% IHC， 芯片， qPCR
个体健康
表达量检测
完全定量
二代和三代测序技术的比较
二代测序—肿瘤研究
研究方向
研究方法
数据库及数据挖掘 TCGA Cosmic ONCOMINE UCSC Xena cBioPortal ... ...
二代和三代测序技术的比较
三代测序—Ion Torrent
Ion Torrent是一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术。
特点 基本原理
当DNA 聚合酶把核苷酸聚合到延伸 不需要昂贵的物理成像等设备，成 中的 DNA链上时，会释放出一个氢 本相对较低，体积小，操作简单； 离子，反应池H+离子 个上机测序可在2-3.5小时内完成； 信号， H+离子信号再直接转化为数 不过整个芯片的通量并不高，目前 字信号，从而读出 DNA序列。 是10G左右，适合小基因组和外显 子验证的测序。
化从而鉴定所通过的碱基。
二代和三代测序技术的比较
Nanopore 主要特点
• 读长长，大约在几十kb，甚至100 kb
• 错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在reads的两端;
• 数据可实时读取； • 通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)； • 样品制备简单又便宜，不破坏DNA; • 直接读取甲基化修饰位点，准确率可达99.8%
二代和三代测序技术的比较
三代测序—Nanopore
Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术，是基于电信号的测序技术。
基本原理 当DNA碱基通过纳米孔时，使电荷发生 变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流 强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是
不同的），灵敏的电子设备检测到这变
生成高品质的植物、动物基因组；
同时检测表观遗传信息； 在单次实验中进行完整的微生物基因 组测序；
二代和三代测序技术的比较
三代测序在肿瘤研究中的应用
SMRT测序能够提供有关癌症基因组复杂性最全面的观点 • 通过对Iso-form多样性的完整检测（包括基因融合、剪接位点和内含子等）发现癌 症样本中隐藏的生物学机制； • 以极高的分辨率检测SV，包括CNV的基因组背景、插入/缺失/倒位/易位的准确断点