荧光光谱分析法课件

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
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二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
l3 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1 →S0跃迁)；发光速度很慢： 10-4~100s、磷光的能量比荧光小
电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 光照停止后，可持续一段时间
2. 荧光的激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌呤类、 吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类 及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青 霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗 坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少 是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析 法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好， 取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域 进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响 同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。
一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有 所增强。这是因为在极性溶剂中，ππ*跃迁所需的能量差△E小， 而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度 也增强。
溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增 加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对 溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上 升，荧光强度下降。
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一 个发射态，如l 3 。
为什么？
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
√ 2.有机化合物的分子结构与荧光的关系
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加
快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光 效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降
低10℃， f增加3％，在80℃时， f为1。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
（3）刚性平面结构：可降低 分子振动，减少与溶剂的相 互作用，故具有很强的荧光 。如荧光素和酚酞有相似结 构，荧光素有很强的荧光， 酚酞却没有。
（4）取代基效应：芳环上 有供电子基，使荧光增强。
√三、影响荧光强度的因素
relation between fluorescence and molecular structure
瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只 是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。
拉曼光：√光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子 把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从 而发射出比入射光稍长或稍短的光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长 的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取 措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光 与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发 光波长
5.荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互 作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为 荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子 、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
6、散射光
小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生 改变而向不同角度散射。
荧光光谱分析法课件
澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
1 nm
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧 光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH<2和pH＞ 13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
★分子能级比原子能级复杂 ★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级 ★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层
★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号S0表示
分子吸收辐射后
S0
电子被激发且不发生自旋方向的改变 ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3…） 电子被激发且伴随着自旋方向的改变 ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为 激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3…）
（2）荧光的发射光谱（荧光光谱） 荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强
度。绘制发射光谱时， 使激发光波长固定在lex处，然后对发 射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度 F 对发射波长l作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。
发射光谱（荧光光谱）的位置？ 磷光光谱的位置？
荧光发射光谱 荧光激发光谱
选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
a:320nm或350nm为激发光，
荧光峰总是在448nm。 b:将
空白溶剂分别在320nm及 350nm激发光照射下测定荧 光，激发光波长为320nm时， 拉曼光波长是360nm， 360nm的拉曼光对荧光无影 响；当激发光波长为350nm 时，拉曼光波长是400nm， 400nm的拉曼光对荧光有干 扰，因而影响测定结果。
外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 生变化的非辐射跃迁。
禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间 跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s
荧光分子都具有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱（荧光光
谱）√。
（1）荧光的激发光谱 激发光谱：表示不同激发波长 下所引起物质发射某一波长荧光的 相对效率。 绘制激发光谱：固定发射波长 (选最大发射波长),然后以不同波长的 入射光激发荧光物质，以荧光强度F对 激发波长l作图，即为激发光谱。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强 度最大，称为最大激发波长 lex
第五章 荧光分析法
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光√
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
跃迁
S0→S1、S2 允许跃迁； S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l4
l1
l2
l3
激发态→基态的能量传递途径√
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
激发光谱与发射光谱的关系√
a. Stokes位移 荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波
长大于激发光波长的现象。 激发光谱与发射光谱之间的波长差值： 振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
辐射和非辐射能量传递过程√
振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s 内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相 应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
小结：激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性； 激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析 法的使用范围
1.有机化合物的荧光分析
脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香 结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照 射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性， 常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物 (衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生