荧光光谱分析法课件
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第3章荧光分析法ppt课件
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而 吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例 比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活 荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而 吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例 比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活 荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
X荧光光谱法(XRF)课件PPT
与其他分析方法相比，X荧光光谱法具 有较高的检测精度和稳定性，操作简 便，对环境和人员无害，尤其适用于 现场快速分析和在线检测等领域。
02 X荧光光谱法的基本原理
原子结构与能级跃迁
01
02
03
原子结构
原子由原子核和核外电子 组成，电子在不同能级上 运动。
能级跃迁
当原子受到外界能量（如 光子）的激发时，电子从 低能级跃迁到高能级，反 之亦然。
环境样品分析
总结词
X荧光光谱法在环境样品分析中具有独特的优势，能够同时测定多种元素，且对样品的 前处理要求较低。
详细描述
X荧光光谱法可用于水质检测，如测定水体中的重金属离子和溶解氧等；还可用于大气 颗粒物分析，了解空气污染物的来源和分布情况。
考古样品分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
总结词
详细描述
X荧光光谱法在考古样品分析中具有重要作 用，能够快速准确地测定文物中的元素组成， 为文物鉴定和保护提供依据。
现状
随着科技的不断进步，X荧光光谱仪器的性能不断提升，检测精度和稳定性不断 提高，同时新型的仪器和应用也不断涌现，如便携式X荧光光谱仪、在线X荧光 光谱仪等。
特点与优势
特点
X荧光光谱法具有非破坏性、快速、 多元素同时分析等特点，能够同时检 测物质中多种元素的含量，且对样品 形状和大小要求不高。
优势
化合物分析
总结词
X荧光光谱法不仅可以检测元素，还可以对化合物进行分析。
详细描述
通过测量不同元素荧光谱线的能量和强度，可以对化合物的类型和结构进行分析。该方法在化学、制药、生物等 领域有广泛应用，可用于药物成分分析、生物组织成分分析等。
样品制备与处理
总结词
为了获得准确的X荧光光谱分析结果，需要对样品进行适当的制备与处理。
02 X荧光光谱法的基本原理
原子结构与能级跃迁
01
02
03
原子结构
原子由原子核和核外电子 组成，电子在不同能级上 运动。
能级跃迁
当原子受到外界能量（如 光子）的激发时，电子从 低能级跃迁到高能级，反 之亦然。
环境样品分析
总结词
X荧光光谱法在环境样品分析中具有独特的优势，能够同时测定多种元素，且对样品的 前处理要求较低。
详细描述
X荧光光谱法可用于水质检测，如测定水体中的重金属离子和溶解氧等；还可用于大气 颗粒物分析，了解空气污染物的来源和分布情况。
考古样品分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
总结词
详细描述
X荧光光谱法在考古样品分析中具有重要作 用，能够快速准确地测定文物中的元素组成， 为文物鉴定和保护提供依据。
现状
随着科技的不断进步，X荧光光谱仪器的性能不断提升，检测精度和稳定性不断 提高，同时新型的仪器和应用也不断涌现，如便携式X荧光光谱仪、在线X荧光 光谱仪等。
特点与优势
特点
X荧光光谱法具有非破坏性、快速、 多元素同时分析等特点，能够同时检 测物质中多种元素的含量，且对样品 形状和大小要求不高。
优势
化合物分析
总结词
X荧光光谱法不仅可以检测元素，还可以对化合物进行分析。
详细描述
通过测量不同元素荧光谱线的能量和强度，可以对化合物的类型和结构进行分析。该方法在化学、制药、生物等 领域有广泛应用，可用于药物成分分析、生物组织成分分析等。
样品制备与处理
总结词
为了获得准确的X荧光光谱分析结果，需要对样品进行适当的制备与处理。
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
X射线荧光光谱分析仪ppt课件PPT
法规与标准
加强国际合作，制定统一的法 规和标准，促进市场规范发展
。
感谢您的观看
THANKS
用途
X射线荧光光谱分析仪广泛应用于地质、冶金、石油、化工、 农业、医药、环境等领域，可对各种材料进行元素分析和化 学成分分析，如金属、非金属、矿物、环境样品等。
优缺点分析
优点
X射线荧光光谱分析仪具有快速、准确、非破坏性、多元素同时测定等优点。同 时，该仪器操作简便，可对各种材料进行无损检测，适用于现场分析和大量样品 分析。
食品安全
用于检测食品中的添加剂、农 药残留等。
考古学
用于鉴定文物年代和成分。
生物医学
用于研究生物组织、药物成分 等。
未来发展方向与挑战
智能化与自动化
提高分析仪器的智能化和自动 化水平，减少人为操作误差。
多元素同时分析
发展多元素同时测量的技术， 提高分析效率。
降低成本与维护
降低仪器成本和维护成本，提 高普及率和应用范围。
信号放大器用于放大测量系统输出的 信号，多道分析器用于将信号分道， 计算机和相关软件则用于处理和分析 数据，并输出结果。
数据处理系统通常包括信号放大器、 多道分析器、计算机和相关软件等部 件。
03 X射线荧光光谱分析仪的 应用
元素分析
总结词
X射线荧光光谱分析仪能够准确测定样品中各元素的含量，广泛应用于地质、环保、化工等领域。
环境样品分析
总结词
X射线荧光光谱分析仪能够用于环境样品中污染物的快速检测和定量分析。
详细描述
环境样品中的污染物通常以痕量或超痕量水平存在，X射线荧光光谱分析仪具有高灵敏度和低检测限 的特点，能够准确测定这些污染物元素的含量，为环境监测和污染治理提供有力支持。
加强国际合作，制定统一的法 规和标准，促进市场规范发展
。
感谢您的观看
THANKS
用途
X射线荧光光谱分析仪广泛应用于地质、冶金、石油、化工、 农业、医药、环境等领域，可对各种材料进行元素分析和化 学成分分析，如金属、非金属、矿物、环境样品等。
优缺点分析
优点
X射线荧光光谱分析仪具有快速、准确、非破坏性、多元素同时测定等优点。同 时，该仪器操作简便，可对各种材料进行无损检测，适用于现场分析和大量样品 分析。
食品安全
用于检测食品中的添加剂、农 药残留等。
考古学
用于鉴定文物年代和成分。
生物医学
用于研究生物组织、药物成分 等。
未来发展方向与挑战
智能化与自动化
提高分析仪器的智能化和自动 化水平，减少人为操作误差。
多元素同时分析
发展多元素同时测量的技术， 提高分析效率。
降低成本与维护
降低仪器成本和维护成本，提 高普及率和应用范围。
信号放大器用于放大测量系统输出的 信号，多道分析器用于将信号分道， 计算机和相关软件则用于处理和分析 数据，并输出结果。
数据处理系统通常包括信号放大器、 多道分析器、计算机和相关软件等部 件。
03 X射线荧光光谱分析仪的 应用
元素分析
总结词
X射线荧光光谱分析仪能够准确测定样品中各元素的含量，广泛应用于地质、环保、化工等领域。
环境样品分析
总结词
X射线荧光光谱分析仪能够用于环境样品中污染物的快速检测和定量分析。
详细描述
环境样品中的污染物通常以痕量或超痕量水平存在，X射线荧光光谱分析仪具有高灵敏度和低检测限 的特点，能够准确测定这些污染物元素的含量，为环境监测和污染治理提供有力支持。
原子荧光光谱分析法
*
阶跃线荧光：
光照激发，非辐射方式释放部分能量后，再发射荧光返回基态；荧光波长小于激发线波长（荧光能量间隔大于激发线能量间隔）；非辐射方式释放能量：碰撞，放热； 光照激发，再热激发，返至高于基态的能级，发射荧光，图(c)B、D ；
Cr原子：吸收线359.35nm；再热激发，荧光发射线357.87nm，图(c)B、D
01
If = Ia 在理想情况下：
02
I0 原子化火焰单位面积接受到的光源强度；A为受光照射在检测器中观察到的有效面积；K0为峰值吸收系数；l 为吸收光程；N为单位体积内的基态原子数；
03
*
三、原子荧光光度计
1．仪器类型
单通道：每次分析一个元素； 多通道：每次可分析多个元素； 色散型：带分光系统； 非色散型：采用滤光器分离分析线和邻近线；
a b c d
*
anti-Stokes荧光：
a b c ห้องสมุดไป่ตู้ d
荧光波长小于激发线波长；先热激发再光照激发(或反之)，再发射荧光直接返回基态；图(d) ； 铟原子：先热激发，再吸收光跃迁451.13nm；发射荧光410.18nm， 图(d)A、C ；
*
直跃线荧光（Stokes荧光）
Pb原子：吸收线283.13 nm；荧光线407.78nm； 同时存在两种形式：
铊原子：吸收线337.6 nm；共振荧光线337.6nm； 直跃线荧光535.0nm；
a b c d
特点：
光源与检测器成一定角度；
*
多道原子荧光仪
多个空心阴极灯同时照射，可同时分析多个元素
*
2．主要部件
光源：高强度空心阴极灯、无极放电灯、可调频激光器； 可调频激光器：高光强、窄谱线； 原子化装置：与原子吸收法相同； 色散系统：光栅、滤光器； 检测系统：
阶跃线荧光：
光照激发，非辐射方式释放部分能量后，再发射荧光返回基态；荧光波长小于激发线波长（荧光能量间隔大于激发线能量间隔）；非辐射方式释放能量：碰撞，放热； 光照激发，再热激发，返至高于基态的能级，发射荧光，图(c)B、D ；
Cr原子：吸收线359.35nm；再热激发，荧光发射线357.87nm，图(c)B、D
01
If = Ia 在理想情况下：
02
I0 原子化火焰单位面积接受到的光源强度；A为受光照射在检测器中观察到的有效面积；K0为峰值吸收系数；l 为吸收光程；N为单位体积内的基态原子数；
03
*
三、原子荧光光度计
1．仪器类型
单通道：每次分析一个元素； 多通道：每次可分析多个元素； 色散型：带分光系统； 非色散型：采用滤光器分离分析线和邻近线；
a b c d
*
anti-Stokes荧光：
a b c ห้องสมุดไป่ตู้ d
荧光波长小于激发线波长；先热激发再光照激发(或反之)，再发射荧光直接返回基态；图(d) ； 铟原子：先热激发，再吸收光跃迁451.13nm；发射荧光410.18nm， 图(d)A、C ；
*
直跃线荧光（Stokes荧光）
Pb原子：吸收线283.13 nm；荧光线407.78nm； 同时存在两种形式：
铊原子：吸收线337.6 nm；共振荧光线337.6nm； 直跃线荧光535.0nm；
a b c d
特点：
光源与检测器成一定角度；
*
多道原子荧光仪
多个空心阴极灯同时照射，可同时分析多个元素
*
2．主要部件
光源：高强度空心阴极灯、无极放电灯、可调频激光器； 可调频激光器：高光强、窄谱线； 原子化装置：与原子吸收法相同； 色散系统：光栅、滤光器； 检测系统：
荧光光谱分析法课件
详细描述
通过观察化学反应过程中荧光强度的变化，可以了解反应过程中各组分的浓度变化，从而推算出反应速率常数和 反应机理等信息。
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
2. 在不同时间点测量荧光 光谱并记录数据。
1. 选择适当的荧光标记的 化学反应体系。
实验步骤
01
03 02
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
总结词
荧光光谱法可用于研究生物大分子间的相互作用，如蛋白质蛋白质、DNA-蛋白质等相互作用。
详细描述
荧光光谱法通过观察荧光标记的生物大分子在相互作用前后 的光谱变化，可以了解生物大分子间的结合方式、亲和力以 及作用机制等信息。
利用荧光光谱法研究生物大分子的相互作用
实验步骤
1
2
1. 将荧光标记的生物大分子进行纯化和制备。
荧光光谱分析法课件
目录 CONTENT
• 荧光光谱分析法概述 • 荧光光谱分析法的基本原理 • 荧光光谱分析法的实验技术 • 荧光光谱分析法的数据处理与分
析 • 荧光光谱分析法的实验案例 • 荧光光谱分析法的展望与未来发
展
01
荧光光谱分析法概述
定义与原理
定义
荧光光谱分析法是一种基于物质吸收 光能后发射荧光特性进行物质成分和 结构分析的方法。
激发态的衰变
电子从激发态返回基态时，以辐射或非辐射方式释放能量，产生荧 光光谱。
荧光光谱的产生机制
荧光光谱是由分子吸收光能后，通过内部转换、振动弛豫和辐射跃 迁等过程产生的。
荧光光谱的组成与特征
荧光光谱的组成
荧光光谱由发射峰、激发峰和斯托克斯位移组成。
荧光光谱的特征
荧光光谱的特征与分子结构、环境因素和激发波长等有关，可用于分析分子的 结构和性质。
通过观察化学反应过程中荧光强度的变化，可以了解反应过程中各组分的浓度变化，从而推算出反应速率常数和 反应机理等信息。
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
2. 在不同时间点测量荧光 光谱并记录数据。
1. 选择适当的荧光标记的 化学反应体系。
实验步骤
01
03 02
利用荧光光谱法研究化学反应的动力学过程
总结词
荧光光谱法可用于研究生物大分子间的相互作用，如蛋白质蛋白质、DNA-蛋白质等相互作用。
详细描述
荧光光谱法通过观察荧光标记的生物大分子在相互作用前后 的光谱变化，可以了解生物大分子间的结合方式、亲和力以 及作用机制等信息。
利用荧光光谱法研究生物大分子的相互作用
实验步骤
1
2
1. 将荧光标记的生物大分子进行纯化和制备。
荧光光谱分析法课件
目录 CONTENT
• 荧光光谱分析法概述 • 荧光光谱分析法的基本原理 • 荧光光谱分析法的实验技术 • 荧光光谱分析法的数据处理与分
析 • 荧光光谱分析法的实验案例 • 荧光光谱分析法的展望与未来发
展
01
荧光光谱分析法概述
定义与原理
定义
荧光光谱分析法是一种基于物质吸收 光能后发射荧光特性进行物质成分和 结构分析的方法。
激发态的衰变
电子从激发态返回基态时，以辐射或非辐射方式释放能量，产生荧 光光谱。
荧光光谱的产生机制
荧光光谱是由分子吸收光能后，通过内部转换、振动弛豫和辐射跃 迁等过程产生的。
荧光光谱的组成与特征
荧光光谱的组成
荧光光谱由发射峰、激发峰和斯托克斯位移组成。
荧光光谱的特征
荧光光谱的特征与分子结构、环境因素和激发波长等有关，可用于分析分子的 结构和性质。
荧光光谱分析法121220讲解
2008年诺贝尔化学奖
2
某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间 内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较 短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿 物 萤石(fluospar)而得名。
我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光
和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光
。
除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子Hale Waihona Puke 第一激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
1 nm
6
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相
应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
12
小结：激发单重态与激发三重态的不同 激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性； 激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁
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磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1 →S0跃迁)；发光速度很慢： 10-4~100s、磷光的能量比荧光小
电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 光照停止后，可持续一段时间
2. 荧光的激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
√ 2.有机化合物的分子结构与荧光的关系
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
★分子能级比原子能级复杂 ★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级 ★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层
★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号S0表示
分子吸收辐射后
S0
电子被激发且不发生自旋方向的改变 ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3…） 电子被激发且伴随着自旋方向的改变 ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为 激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3…）
荧光光谱分析法课件
澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
1 nm
跃迁
S0→S1、S2 允许跃迁； S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l4
l1
l2
l3
激发态→基态的能量传递途径√
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌呤类、 吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类 及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青 霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗 坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少 是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析 法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好， 取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域 进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加
快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光 效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降
低10℃， f增加3％，在80℃时， f为1。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一 个发射态，如l 3 。
为什么？
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
l3 > l 2 > l 1 ；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
辐射和非辐射能量传递过程√
振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s 内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相 应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
小结：激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性； 激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析 法的使用范围
1.有机化合物的荧光分析
脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香 结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照 射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性， 常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物 (衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。
荧光分子都具有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱（荧光光
谱）√。
（1）荧光的激发光谱 激发光谱：表示不同激发波长 下所引起物质发射某一波长荧光的 相对效率。 绘制激发光谱：固定发射波长 (选最大发射波长),然后以不同波长的 入射光激发荧光物质，以荧光强度F对 激发波长l作图，即为激发光谱。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强 度最大，称为最大激发波长 lex
5.荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互 作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为 荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子 、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
6、散射光
小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生 改变而向不同角度散射。
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧 光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH<2和pH＞ 13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 生变化的非辐射跃迁。
禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间 跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s
第五章 荧光分析法
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光√
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 光照停止后，可持续一段时间
2. 荧光的激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
√ 2.有机化合物的分子结构与荧光的关系
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
★分子能级比原子能级复杂 ★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级 ★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层
★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号S0表示
分子吸收辐射后
S0
电子被激发且不发生自旋方向的改变 ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3…） 电子被激发且伴随着自旋方向的改变 ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为 激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3…）
荧光光谱分析法课件
澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
1 nm
跃迁
S0→S1、S2 允许跃迁； S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l4
l1
l2
l3
激发态→基态的能量传递途径√
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌呤类、 吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类 及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青 霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗 坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少 是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析 法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好， 取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域 进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加
快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光 效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降
低10℃， f增加3％，在80℃时， f为1。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一 个发射态，如l 3 。
为什么？
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
l3 > l 2 > l 1 ；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
辐射和非辐射能量传递过程√
振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s 内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相 应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
小结：激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性； 激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析 法的使用范围
1.有机化合物的荧光分析
脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香 结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照 射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性， 常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物 (衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。
荧光分子都具有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱（荧光光
谱）√。
（1）荧光的激发光谱 激发光谱：表示不同激发波长 下所引起物质发射某一波长荧光的 相对效率。 绘制激发光谱：固定发射波长 (选最大发射波长),然后以不同波长的 入射光激发荧光物质，以荧光强度F对 激发波长l作图，即为激发光谱。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强 度最大，称为最大激发波长 lex
5.荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互 作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为 荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子 、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
6、散射光
小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生 改变而向不同角度散射。
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧 光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH<2和pH＞ 13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 生变化的非辐射跃迁。
禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间 跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s
第五章 荧光分析法
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光√
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。