第四讲 酶催化、生物催化与微生物

levotartaricus) 微 生 物 催 化 环 氧 马 来 酸
(10.8)的水解反应，其产物为 (S,S)-酒石酸 (10.9)；而以枯草杆菌微生物催化（10.8） 的水解产物则为(R,R)-酒石酸（10.10）。
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• 这种严格的立体结构选择性，对有机合成 特别是药物合成来说是非常重要的。因为 药物的异构体不仅无效或低效，并且往往 还有副作用，甚至有相反的药效和强力的 毒性。
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• 微生物转化反应是酶催化反应，在最适条
件下，酶能在一秒钟内使 102 ～ 106 个底物
分子转变成产物。
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3 微生物转化收率高、成本低
• 微生物转化反应是在全细胞内进行，保持
原有整体酶系统比较符合生物催化所需环
境与条件，在氧化 -还原等催化反应时不需
添加辅酶（辅酶非常不稳定，难以分离制
取，这是酶法合成中很难补救的）。
O (10.6)
O
(10.7)
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• 例如来自黑根霉生物体的酶选择性氧化羟 基黄体酮（10.4）的11-位氢，生成11α-羟 基黄体酮（ 10.5 ）；而来自新月弯孢霉生 物体的酶则选择性地氧化甾体化合物的 （ 10.6 ）的 11- 位非对映异构体氢，形成 11β-羟基化合物（10.7）。
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（3）区域选择性
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微生物转化实验过程
• • • • 选择菌种 成熟菌丝或孢子的培养 选择适当的转化方式？ 转化培养(即生物转化)或转化菌丝及孢子悬 浮液转化 • 转化液的分离提取 • 产品精制
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3 微生物转化方法
• 生长细胞培养转化法 • 静止细胞培养转化法
• 固定化细胞转化法
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生长细胞培养转化法
• 生长细胞培养转化法，是在微生物细胞培
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• 应用干细胞进行转化是另一种静止细胞转 化法，便于贮备随时使用。干细胞制备有 两种方法，冷冻干燥法和丙酮干粉制备法。
• 静止细胞培养转化法的优点是产物后处理 简单、没有培养基成分的污染，缺点是增 加了额外的菌体收集与重悬过程。
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固定化细胞转化法
• 固定化细胞转化法是指利用化学或物理手
段将游离的细胞定位于限定的空间区域并
使其保持活性及可以反复使用的特性，然 后用于催化有机化合物的生物转化得到所 需产物的方法。
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• 制取固定化细胞的方法分为两大类：
• 将细胞与固定材料通过化学反应相结合或
分子键的缔合，称共价键合； • 将整个细胞包埋在胶质材料（如角叉菜胶、 卡拉胶和海藻胶等）内，称包埋法。
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• 目前获得广泛应用的固定化方法有聚丙烯
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• 利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化
剂实现化其
本质是利用微生物细胞内的酶催化有机化合
物的生物转化，又称微生物生物转化。
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• 微生物生物转化在有机合成中有着重要的 用途，它能提供廉价和多样的生物催化 剂 —— 酶，或以完整细胞直接进行生物催
养前或培养一段时间后，直接将底物投入
到微生物生长培养基中，利用微生物自身
繁殖生长的同时对底物进行生物转化。
• 这种转化一般在摇瓶或发酵罐中进行培养
转化。
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• 摇瓶转化实验主要用于筛选菌种和发酵罐 放大转化反应条件的选择。 • 在通气的条件下将微生物培养至生长旺盛 的对数生长期的中期，或在后期所产生酶 的晚期时加入底物进行转化；极个别也有 在生长早期加底物，此根据转化需要的酶 生长情况。
OH R1
O OR2
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面包酵
H-
OH R1
O 面包酵母 OR2
H-
O R1
O OR2
β酮 面包酵母 酯
R1小 COOR2大
面包酵母 OH R1 O OR2
母 R1
β-酮酯
O
O OR2
R1大 COOR2小
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• 氢负离子按 Prelog 规则从空间位阻小的一
面向羰基亲核进攻，形成稳定的优势中间
体，还原醇的手性中心构型由底物结构决
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• 加入的底物可以粉末状的固体或底物的水 溶液，必要时也可以应用有机溶剂；投料 方式可以一次或分批。
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• 生长细胞培养转化法是最简单和最常用的 一种方法，优点是微生物生物转化容易、
效率高，缺点是产物的后处理及分离纯化
烦琐。
• 一般适用于经过诱变处理的微生物菌株，
它可以底物作为唯一碳源，也能适应连续
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2 微生物转化实验过程
• 微生物转化实验的简要过程如下：
选择菌种→成熟菌丝或孢子的培养→选择 适当的转化方式→转化培养(即生物转化)或 转化菌丝及孢子悬浮液转化→转化液的分 离提取→产品精制
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（1）选择菌种
• 选好菌种是进行转化反应的关键步骤；可
以根据转化反应类型，选择能产生催化这
类反应酶的微生物。一般可向国家、地方 保管菌种委员会或学校、研究机关去函索 取、购买。
酰胺聚合的固定化方法和角叉菜胶的包埋 法，其固定化细胞也可悬浮于培养基中发 酵生长同时进行生物转化，以保证辅酶的 再生以及新活细胞的生长。
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• 固定化细胞转化最大优点可以长期反复使
第四讲 酶催化、生物催化 与微生物转化
1
• 酶是生物催化剂，生物催化剂不仅包括从 生物体（微生物、动物、植物）中提取的 各种游离酶，还包括可以直接作为酶源使 用的各种生物细胞、固定化的酶和固定化 细胞。
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• 因此生物催化剂可以是微生物、动物、植 物的整体细胞，也可以是从细胞中提出来 的酶。它们可以游离的形式使用，也可以 采用固定化技术将其固定在多孔介质表面 后再使用。
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• 例如维生素C生物合成中基因重组葡萄糖酸 氧化杆菌的代谢工程菌，将 L- 山梨糖脱氢 酶基因和 L- 山梨酮脱氢酶基因，通过基因 重组构建成一个代谢工程菌，发酵可以在 同一次转化发酵中将 D- 山梨醇转化成 α- 酮 L-古洛糖酸。
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第二节 生物转化实验方法
• 1 生物催化剂的来源与制备方法
化。
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• 在生化反应过程中，若采用活细胞 (包括微 生物、动物、植物细胞 ) 为催化剂时称发酵 或细胞培养过程，若采用游离酶或固定化 酶时称为酶催化过程。
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• 它们的区别在于发酵过程中除得到反应产 物外，还可能得到更多的生物细胞，而酶 反应过程中，酶则不会增长。上述两类反 应过程，从催化作用的实质看是没有什么 区别的，利用活生物细胞作为催化剂的发 酵生化反应，其实质也是通过生物细胞内 部的酶起催化作用。
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• 特别像生理活性很高的激素、抗生素以及
心血管系统和神经系统等药物的药效对立
体结构的要求很高．往往具有严格对映体 构型的要求，此为有机化学合成方法难以 达到的。
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2 微生物转化反应条件温和、设备简单、 公害少并且反应速率快
• 微生物转化反应一般都在常温和 pH 为 7 左 右进行催化合成，无需高压、强热等苛刻 的条件，所以设备简单，反应条件温和， 生产安全；原料除底物和普通培养基外没 有其他化学品，因此一般无公害。
化生产过程。
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静止细胞培养转化法
• 静止细胞培养转化法，是把微生物细胞在
一定的条件下培养一段时间后，经离心收
集菌体，将菌体悬浮于水或缓冲溶液中，
然后加入底物，在适宜的温度、 pH和振荡
条件下进行转化的方法。
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• 静止细胞转化法是将一种生长影响减至最 小情况下进行生物转化。 • 它通过提高菌丝体浓度可以达到加快转化 速率的目的。
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（2）配制培养基
• 一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满
和富含需要的酶。按转化菌种的培养特征
和转化反应需要配制培养基。 • 为成熟菌丝或孢子的培养做准备。
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（3）投转化底物
• 选择适当的菌株生长期加底物，并考虑选
择加底物的方法(例如固体加料或液体加料)
和方式(例如连续或间歇加料)。
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（4）添加刺激剂或抑制剂
粪产碱杆菌 HO
诺卡氏菌 COOH
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• 应用粪产碱杆菌对乙基环己烷选择性氧化
时仅作用于 4- 位上的次甲基，生成反式乙
基环己烷醇，侧链不起氧化反应；而诺卡
氏菌对丁基环己烷选择性氧化时，仅作用
于环己烷的侧链丁基，生成环己烷丁酸，
显示了酶的区域选择性氧化反应。
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（4）面选择性
• 无环β-酮酯易被酵母还原为 β-羟酯， β-羟 酯(这种产物)是β-内酰胺、昆虫激素和类胡 萝卜素等合成的手性源。
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（2） 非对映异构体选挥性
• 非对映异构体选择性是指对非对映异构体
的氢或基团进行催化反应，导入一个非对
映体的基团。这类选择性生物催化的例子，
大多是对亚甲基中2个非对映体氢的进行催
化，导入一个基团。
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黄体酮
O
O CH3 黑根霉 HO
CH3
O (10.4)
O O CH2OH OAc 新月弯孢霉 HO (10.5) O CH2OH OAc
• 添加刺激剂的目的是提高酶活力和增加酶
生长量。添加抑制剂的目的是抑制酶副反
应或抑制其他对反应不良酶的生长。
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(5) 转化过程中各项影响因素的控制
• 例如开始加底物时间，加入的底物和转化
的产物在转化环境中最大稳定的滞留时间；
适宜的转化温度；pH值和菌丝浓度等。
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（6）转化反应终点的控制
• 根据影响转化反应的各种因素，控制好转
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第一节 微生物转化反应的特点
• 微生物转化反应，可以采用发酵方式进行
转化，也可以按静止的洗涤细胞或固定化
细胞等方式进行连续生产。它与有机化学
合成和酶法合成相比较有下列特点。
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1 对立体结构合成具有高度的专一选择性
• 微生物转化反应是一种酶的催化反应，对 底物(即反应物)作用时，具有高度的立体结 构选择性；它不仅对结构有化学选择性和 非对映异构体选挥性，并且有严格的区域 选择性、面选择性和对映异构体选择性。
化反应培养终点，使底物转化达最大反应
完全值。当取样分析反映转化培养液中转
化产物积累量不再增加时，立刻采用物理
方法将菌丝体(包括转化反应的胞外酶)及培
养物除去来停止转化反应。
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（7）分离精制转化产物
• 转化产物已与生物转化系统分开，可按化 学方法将产物分离精制。一般来说转化过 滤液中杂质含量大，产物浓度低。
定，即与羰基两侧取代基的大小有关。
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（5）对映异构体选择性
环氧马来酸
粪产碱杆菌
H
O
H
H COOH
OH
H
HOOC
枯草杆菌
(10.8)
COOH HOOC OH (10.9) (S,S)-酒石酸 OH H H HOOC OH COOH (10.10)
(R,R)-酒石酸
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• 如 一 种 粪 产 碱 杆 菌 (Alcaligenes
• 2 微生物转化实验过程
• 3 微生物转化方法
• 4 微生物转化的影响因素
• 5 产物的检测与分离纯化 • 6 对映体过量
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1 生物催化剂的来源与制备方法
• 离体酶主要来源于动物、植物、微生物等
的含酶细胞、组织或器官，通过提取法可
制得多种离体酶。
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• 例如，从动物胃中提取分离胃蛋白酶；从 动物胰脏中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰 脂肪酶，或这些酶的混合制剂胰酶；从动 物血液中提取超氧化物歧化酶（ SOD ）； 从木瓜中提取木瓜蛋白酶；从波萝中提取 波萝蛋白酶；从大肠杆菌中提取谷氨酰胺 酶等。
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• 微生物转化反应可以持续进行，反应量大， 收率高，可以大规模工业生产。加上设备 和原料简单易得等优点，生产成本不仅低 于酶法合成，并且也低于化学合成。
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4 微生物转化可以减少反应步骤
• 通过酶合成基因构建得到的基因工程菌， 可以将原需几步催化中间体过程在一次发 酵中转化完成。
• 将几步中间体合成中转化酶的合成基因， 通过基因构建于同一个工程菌中，在发酵 法转化时需几步催化合成的中间体就能一 步转化成功。
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（1）化学选择性
• 同一微生物在不同的培养基中培养，其转 化底物产生不同的化学选择性。
O
3-氰基吡啶
CN
红球菌 COCl2
光气
NH2 N (10.2) O OH N (10.3)
10
N (10.1)
红球菌
2-甲基丁腈
CN
• 例如红球菌生长在含有 COCl2 培养基中，所 产 生 的 酶 将 底 物 （ 10.1 ） 水 解 为 酰 胺 （10.2）；而生长在含有 2-甲基丁腈培养基 中，所产生的酶将底物（10.1）水解为羧酸 （10.3）。
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• 完整细胞主要来自于微生物，通过微生物
发酵法来制备各种含酶细胞。例如以酿酒
酵母为菌种进行发酵，可得到含有丙酮酸
脱羧酶和乙醇脱氢酶等多种酶和辅酶的酵
母细胞。
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• 有机合成中所用的酶一般为粗品，其酶含 量仅有1％～30％，其余是无活性的蛋白质、 稳定剂、盐或者含有提取过程中混杂进来 的多糖。酶的粗品比纯品更为稳定，但粗 酶催化反应的副产物多。随着蛋白质分离 纯化技术的发展，生物催化反应中纯酶的 使用正在逐步增加。