第二章 产酶微生物的分离与筛选

诱变剂及其诱发机理
1. 物理诱变剂 物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、X射线、γ射 线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。 生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长 处，该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理 是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子 之间发生交联反应。
a. 交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相 邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形 成。它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对， 造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。
2.3.1 优良菌种的诱变育种
1. 诱变育种 诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散 的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后 采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数
符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究
用。
2 诱变育种方法
诱变育种的基本过程如下：
选择合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱 变处理→筛选→保藏和扩大试验
(6)曲霉(Aspergillus)



分类：多数属于子囊菌亚门， 少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气 和谷物上，可引起食物、谷物 和果蔬的霉腐变质，有的可产 生致癌性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉Asp. Niger、 黄曲霉Asp.flavus 应用：是制酱、酿酒、制醋的 主要菌种。是生产酶制剂（蛋 白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌 种。生产有机酸（如柠檬酸、 葡萄糖酸等）。农业上用作生 产糖化饲料的菌种。
2.2.2 富集培养
1. 添加特殊的营养物质
2. 调整培养基的酸碱度 3. 控制培养温度和热处理
4. 添加抑制剂
2.2.3 分离
通常采用平板分离法。将含菌样品用无菌水 或生理盐水稀释到适当的浓度，然后涂布在 适当的平板上，根据微生物的种类选择培养 条件。根据不同的微生物种类采用不同的培 养基、抑制剂。
Chapter 2 Isolation and Purification of Microorganisms Producing Enzyme
产酶微生物的分离与纯化
酶的生产方法
提取分离法 (Extraction)
生物合成 (Biosynthesis)
化学合成 (Chemicalsynthesis)
(3) 移码突变的诱变剂:吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、
吖啶橙及α -氨基吖啶等)和称为ICR类的化合物 移码突变:是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个 或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面 的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由 移码突变产生的突变体称为移码突变体。 作用机制：它们是一种平面型的三环分子，与嘌呤-嘧 啶碱基对的结构十分相似，故能嵌入两个相邻的DNA 碱基对之间，造成双螺旋的部分解开(两个碱基对原来 相距0.34纳米，当嵌入一个吖啶类分子时，就变成 0.68纳米)，从而在DNA复制过程中，会使链中增添或 缺失一个碱基，结果引起移码突变。

(1) 大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著 名的原核生物。




形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0 um，革兰氏阴性，运动 (周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展， 光滑，闪光。 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致 病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要 求低。 应用： 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等
碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤， 并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。胸腺嘧啶被烷 基化后，可与鸟嘌呤错误配对。
(2) 碱基类似物:有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP) 它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被 错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱 基置换的作用是间接的。
Few example
Contents of chapter 2
2.1 产酶微生物
2.2 产酶微生物的分离和筛选
2.3 产酶微生物优良菌种的选育
2.4 产酶微生物原生 常见产酶微生物
基本要求：

不是致病菌 发酵周期短,产酶量高 不易变异退化 最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。 对医药和食品用酶,还应考虑安全性： 凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶, 安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中 毒实验。
（1）出发菌株的选择
a. 自然界直接分离到的野生型菌株
b. 经历过生产条件考验的菌株
c. 已经历多次育种处理的菌株
(2) 制备菌悬液
a. 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性 和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的 措施促使细胞处于同步生长。 b. 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106～ 107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水 (0.85%NaCl)稀释。 表型延迟 Phenotypic lag ：所谓的表型延迟就是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不 纯的菌落。 生理性延迟现象：生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变， 并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变 性状。
2. 化学诱变剂
(1) 与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺 烷化剂(alkylating agent)： 带有一个或多个活性烷基， 带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分 别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至 其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其 与DNA中的碱基或磷酸作用。 常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲 基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
2.3.2 突变株的分离与筛选
突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条 件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定 的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的 特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原 养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是 决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。 为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以 充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培 养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、 浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。 同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一 致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。
(3) 诱变处理 通常是根据经验选择恰当的诱变剂,对于已有诱变处 理背景的菌株，变换使用其它诱变剂也许会得到较好 的效果。 要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就 一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达 到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对 于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用 高剂量，就是造成菌体致死率在90%～99.9%时的剂 量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰 了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向 于采用低剂量(致死率在70%～80%),甚至更低剂量(致 死率在30%～70%)，他们认为低剂量处理能提高正突 变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。
2.2.4 初筛
1. 胞外酶的产酶菌株的筛选方法
2. 胞内酶的产酶菌株的筛选方法
如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定： (1) 固体培养法 把菌种接入固体培养基中，保温 数天，用水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定 酶活力，这种方法主要适用于霉菌；
(2) 液体培养法 将菌种接入液体培养基后，静置 或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测 定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能 较高的菌种供复筛使用。
2.2.4 初筛
通过平板分离的初筛法得到的产酶军注重， 需要进一步复筛。复筛时可以采用几种代表 性的培养基，在预定的几种培养条件下，对
每一个菌株进行培养，并测定其产酶能力。
由于同一种菌株可因培养方式的不同表现出 不同的产酶能力，因此，最好将摇瓶实验和 小发酵罐实验相结合判断菌株的优良性。
2.3 产酶微生物优良菌种的选育
SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea …… organ/tissue/cell
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture


直状、近直状的杆菌， 周生或侧生鞭毛，革兰 氏阳性，无荚膜，芽孢 0.5×1.51.8m，中生 或近中生。 枯草芽孢杆菌是工业发 酵的重要菌种之一。生 产淀粉酶、蛋白酶、 5’-核苷酸酶、某些氨 基酸及核苷。
(4) 根霉(Rhizopus)





分类学上属于藻状菌纲，毛霉目， 根霉属。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名 （假根的功能是在培养基上固着， 并吸收营养）。 分布于土壤、空气中，常见于淀粉 食品上，可引起霉腐变质和水果、 蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（R.oryzae)黑根 霉(R.nigrican)等。 应用：根霉能产生一些酶类，如淀 粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产 这些酶类的菌种。在酿酒工业上常 用做糖化菌。有些根霉还能产生乳 酸、延胡索酸等有机酸。
暗修复(dark repair) 作用：可修复由紫外 线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。 野生型大肠杆菌细胞的切除修复系统非 但可以修复自身的DNA紫外线损伤，还 能修复外来的噬菌体T1及T3等的DNA所 受到的紫外线损伤。