重金属与蛋白质作用的光谱研究

重金属与蛋白质作用的光谱研究李媛媛（天津科技大学海洋科学与工程学院,天津 300457）摘要:蛋白质是细胞内的功能分子，在所有的生命过程中起着关键的作用，具有运载和储存功能，其特定结构与其生物功能密切相关。

血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,具有许多重要的生理功能,可与许多化学物质以不同方式结合，并携带着这些物质通过血液在体内进行转运、运输、分配和代谢。

重金属离子进入动物体内与蛋白质发生作用，可能会影响或改变蛋白分子固有的结构和功能。

本文介绍了蛋白质的结构，血清白蛋白的结构，重金属离子与血清白蛋白作用的光谱研究方法，重点是荧光光谱法。

关键词：重金属；血清白蛋白；光谱方法Research on Action of Heavy Metal and ProteinLi Yuanyuan(Tianjin University of Technology&Science Marine science and Engineering college,Tianjin 300457)Abstract:Protein as the essential biological material in the cells has been playing manyvitalroles for all kinds of biological phenomena.It has many important functions such as transportation and distribution,whose biological function is dependent on its special structure.Serum Albumin (SA) is the most abundant carrier protein in blood.Serum albumin hasmany important physiological functions.For example,by binding to chemicals,serum albumin realizetheir transportation, distribution and metabolismin the body.This paper introduced the construction of protein and serum albumin,spectrum methodology of the interaction of heavy metaland serum albumin,stressing the spectrum methodology of the fluorescence.Keywords:Heavy Metal,Serum Albumin,Spectrum1. 前言1.1 概述蛋白质是构成生命体最重要的有机物质之一，也是生物学中最基本的功能单元之一。

他们能起多种作用，包括物质的输送(如血红蛋白载氧)，生命反应的催化(酶)，生物材料的(肌肉，骨骼，毛发等)的形成、发生免疫反应或通过与其它蛋白质相结合起调节作用。

由于蛋白质在几乎所有的生物学过程中都起着极其重要的作用，因此对蛋白的结构功能关系的研究自然就构成了从分子水平上认识生命现象的重要方面[1]。

探索蛋白质的构象、组成、结构，研究药物、染料、表面活性剂、有机有毒小分子、离子、量子点等小分子与蛋白质的相互作用机理和作用过程，了解在客体分子作用下蛋白质结构与功能等方面的变化，不仅对研究生物大分子和小分子(包括有机小分子、离子、量子点等)相互结合作用的配位本质、促进生命科学的发展有着重要的意义，而且对改进和发展检测蛋白质的方法也有促进作用。

此外，其在药代动力学及临床药理学上也具有重要意义。

因此，该领域己成为从事生命科学、化学、药代动力学和临床医学科研者共同关注的课题[2,3]。

近年来，国内外有关研究也日趋活跃。

蛋白质的种类繁多，目前已经商品化的种类也较多。

根据研究目的和任务不同，可选取具有不同功能的蛋白质如血清白蛋白、血红蛋白，免疫球蛋白，胆汁蛋白,卵清蛋白等为模型蛋白。

其中，血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，是生物体内具有重要生理功能的大分子，它可以同许多内源性和外源性物质结作者简介：李媛媛（1986-），女,学生，e-mail:583936263@合，起着重要的储存和运输作用。

并且，血液中血清白蛋白浓度长期以来一直是检验健康和疾病的指标。

与其它蛋白质相比，血清白蛋白具有分子量小、水溶性好、稳定性高、易提纯制备，分子结构确知等优点，在临床药物研究中一直作为模型蛋白，也是研究高分子蛋白物理化学性质、结构与功能、临床应用以及变异方面的理想蛋白质，因此，在药理学、临床医学和分子生物学等方面有重要的应用价值[4]。

1.2 蛋白质的结构蛋白质有一个引人注目的特征，就是他们都具有特定的三维结构。

虽然蛋白质是由氨基酸首尾相连的多肽组成，但一个伸展开来或随机排布的多肽链并无生物活性。

蛋白质的功能来自其特定的构象(conformation)，即原子在一个结构中的三维排布方式。

蛋白质由氨基酸结合而成，结合方式是通过肽键连接成肽链，再由一个或多个肽链按各自特殊的方式结合成为蛋白质分子。

随着氨基酸残基的数目、排列顺序、以及多肽链的数目和空间结构的不同，形成不同的蛋白质。

1.3 血清白蛋白的结构特点牛血清白蛋白BSA分子由583个氨基酸构成，分子量约为66000；人血清白蛋白HSA是由585个氨基酸残基组成，分子量约为66500。

两者的结构中均包括17对二硫键:其类球状高级结构可以分成3个结构域(domain)，从N一端开始依次为domain I，domain II和domain III，这些结构域主要由α-螺旋体反向平行形成:每个域又以槽口相对(grooves towards each other)的两个疏水性空腔一亚域(sub domain A 和sub domain B)形成。

除此之外，HSA和BSA分子内还有诸如β折叠(shit)，β回转(turn)以及无规卷曲等二级结构类型。

在生理pH下两者的α-螺旋含量均为67%。

1.4 重金属离子与蛋白研究的现状血清白蛋白是哺乳动物中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质。

由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯，从50年代开始，人们对血清白蛋白与重金属离子的相互作用展开了大量研究，以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。

在生物系统中，蛋白质同金属离子有着密切的关系。

金属一蛋白质的配合物是生物化学中的中心研究课题之一。

许多蛋白质的侧基和端基与大多数金属离子均有潜在的键合能力。

Ag+与肽、蛋白质和氨基酸形成配合物；同含有氮和氧的给予体原子形成的配合物易还原为金属凝胶。

Cu2+能与BSA，α-酪蛋白、β-乳球蛋白、γ一球蛋白和细胞色素、RNA，DNA等形成配合物。

在金属一蛋白质配合物的研究中，既有二元配合物，也有三元配合物的报道。

血清白蛋白与许多金属离子，如Cu2+，Ni2+，Ca2+，Zn2+，Cd2+，Mn2+，C02+，Cr2+，H g2+等的相互作用己进行了较为广泛的研究，与稀土金属离子作用的研究最近也有很多的报道。

蛋白质是生物体内最重要的生物大分子之一，它在植物体内担任多项重要功能，因此，蛋白质的代谢变化也将在一定程度上直接反应生物对重金属胁迫的抗性适应能力大小。

生物在生长过程中抗性能力大小与体内蛋白质合成的数量、变化规律呈正相关，即蛋白质代谢变化波动越大、紊乱程度越高，则说明生物对胁迫环境的适应性越差；凡生物体内蛋白质的合成呈稳定、规律性变化，其抗性比蛋白质合成代谢紊乱的种群或个体的抗性能力要强。

环境中的重金属能够以不同的形态存在，包括价态、化合态、结构态和结合态，其中最复杂的是结合态。

食品中的重金属主要以结合态存在，己有不少关于这方面的研究报道。

不同结合形态的重金属对动物和人体具有不同的毒性。

由于蛋白质是生物大分子，环境条件的改变，如蛋白质变性剂、酶消化剂会破坏蛋白质的结构，因此，与蛋白质相结合的重金属形态也会发生变化。

为了正确评价食品或其其它来源的重金属对动物和人体的毒性，需要研究其存在形态和它们的稳定性。

2.光谱研究方法从化学的角度看，重金属与蛋白质的研究分为结构研究与结合平衡研究二个方面，从研究手段上看，主要的光谱法有紫外一可见光谱法、荧光光谱法、红外光谱法以及圆二色谱法等。

2.1 荧光光谱法研究重金属离子与蛋白质的相互作用，荧光光谱法是应用最广泛的一种方法。

该方法能够提供较多的荧光参数如激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等，这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况以及发光特性。

通过对这些参数的测定，可得到许多关于蛋白质与重金属离子作用的信息如结合常数、结合位点数、结合位置、作用力类型以及蛋白质分子在相互作用中结构的变化等有用的信息，从而阐明蛋白质结构与功能的关系。

同时，荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、样品用量少、操作简便等优点。

蛋白质分子中的色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)三种芳香族氨基酸残基能发射荧光，所以蛋白质属于内源性荧光物质。

三种氨基酸(Trp, Tyr以及Phe)由于其侧链生色团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱特征，三种氨基酸在相同条件下的荧光强度之比约为100:9:0.5[5,6],Trp残基对微环境极性的变化很敏感。

对于BSA和HSA，通常以280nm或295nm的单色光作为激发光，当激发波长为280nm时，Phe在绝大多数实验条件下不被激发，所以很少能观察到Phe的发射，这样BSA或HSA的内源荧光主要来自Trp和Tyr残基；当激发波长为295nm时文献认为Phe和Tyr均不被激发，也无相应的发射，所以选用295nm作为激发光源的波长时，可以认为BSA或HSA的内源荧光全部来自Trp残基。

除此之外，荧光偏振(fluorescence polarization)、同步荧光(Synchronous luorescence)扫描以及时间分辨(time-resolved)荧光实验技术也有少量应用报道。

2.1.1 荧光猝灭法广义上说，荧光猝灭是指任何可以使荧光强度降低的作用，但狭义的定义仅指由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起的荧光强度降低的现象。

许多过程可引起荧光猝灭，如：激发态反应、能量转移、配合物形成和碰撞猝灭等。

这种使荧光强度下降的物质称为荧光猝灭剂。

荧光猝灭大体上可分为静态猝灭和动态猝灭。

动态猝灭过程中，在荧光物质的激发态寿命期间，猝灭剂必须扩散到荧光发射基团，碰撞接触后荧光物质返回到基态而不发射光子，碰撞过程中发生能量转移或电子转移，这是一个时间依赖的过程;在静态猝灭过程中，基态荧光分子和猝灭剂发生反应，生成不发荧光的基态复合物，这种基态复合物吸收光子后并不发射光子，而是很快返回到基态。