α-淀粉酶分离提纯技术研究进展

α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
摘要：为了更好地研究α-淀粉酶的性质与应用α-淀粉酶，我们需要不断地从不同的生物体内提取α-淀粉酶并将其高纯化。

随着生物技术的不断发展，分离提纯的方法也越来越复杂越精确，然而它却为生物学的发展奠定了一定的基础，此篇综述简要地说明近年来国内外在α-淀粉酶的分离纯化等方面成就，也部分介绍了α-淀粉酶的研究现状和工业应用以及发展前景。

关键字：α-淀粉酶分离提纯现状应用前景
α-淀粉酶(α-Amylase)是一种内切葡萄糖苷酶，属于淀粉酶。

米黄色、灰褐色粉末。

能水解淀粉中的α-1,4,葡萄糖苷键，在催化水解α-1,4-糖苷键只能催化水解直链淀粉，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。

能将淀粉切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，即起到降低稠度和“液化”的作用，所以此类淀粉酶又称为液化酶。

作用温度范围60-90℃，最适宜作用温度为60-70℃，作用pH值范围5.5-7.0，最适pH值为6.0。

Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力，并且对其稳定性的提高也有一定效果。

主要存在于人的唾液和胰脏中也存在于麦芽、蟑螂涎腺、芽胞杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。

一、α-淀粉酶分离提纯的研究历史与现状
1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉(Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲 600单位。

用硫酸铵分段沉淀，Sephadex G一75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化，经PAGE 鉴定为一条带。

以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖分别占6.4％、32.3％、37.1％、10.9％。

麦芽糖和麦芽三糖二者之和占69.4％,与Novo公司Norman报道的相似，属糖化型α-淀粉酶，可用于制糖、啤酒和面包食品工业，并可以替代一淀粉酶生产麦芽糖浆。

米曲霉α-淀粉酶作为面包添加剂比细菌α-淀粉酶耐热性低，避免面包在制造过程中造成过度液化现象，而使生产的面包发粘，在当时此酶是目前较理想的面包食品类的添加剂。

1992年姜涌明等采用壳聚糖絮凝、淀粉吸附、乙醇沉淀等步骤，从枯草芽孢杆菌86315发酵液中提取了α-淀粉酶。

然后用Sepbadex G一100凝胶过滤、DEAE—纤维素柱层析进一步提纯，得到DISC-电泳一条带的淀粉酶制剂，从而更好地研究其动力学问题。

1994年西北大学李汉、李华儒等率先开发了一个用强阴离子高效液相色谱分离纯化α-淀粉酶的新方法，在给定的条件下纯化工业α-淀粉酶，其活性回收率达96％，比活性为388u／mg蛋白质．纯化倍数提高30倍，经SDS-PAGE分析，得到分子量分别为58K和33K两条α-淀粉酶谱带。

此法纯化α-淀粉酶简单、快速、救率高，不仅能纯化工业粗酶，也可纯化其它来源的α-淀粉酶。

在当时，此法的研究成功为大规模制备高纯度α-淀粉酶提供了一个新工艺路线。

在1995年时，唐梓进、肖俊方等针对工业α-淀粉酶常混有其他酶类的问题，改良了淀粉微球亲和吸附纯化α-淀粉酶的方法，将淀粉做成网状结构微球，作为亲和吸附载体，装柱后用于吸附、纯化淀粉酶。

此球机械强度大，对酶吸附量高达125mg／mL床体积。

低温条件下(4℃)操作，球与酶很少反应，重复操作9次未见明显变化。

工业生产较纯的酶经一次过柱后，酶比活仍提高2.3倍，每克干粉酶活提高16.5倍。

整个操作过程简单、方便，酶失活很少，过柱后回收率高达91.6％。

此球既适用于工业生产中纯化淀粉酶，也适用于实验室中淀粉酶的
纯化及分析；淀粉球对淀粉酶吸附及解吸时pH值和离子强度的改变、酶本身构象变化的研究，又能为酶与底物间相互作用提供理论依据。

2004年景娟等再次对不同龋敏感者唾液α-淀粉酶的研究，采用XDF-SGM 型疏水柱，通过疏水色谱技术来分离提纯唾液α-淀粉酶，取得了满意的效果。

2005年复旦龚振华等教授通过醋酸纤维薄膜电泳，将正常人血清和PBM患者胆汁和血清中淀粉酶初步分离提纯，继经等电聚焦和SDS-PAGE二位电泳，得到纯化淀粉酶同工酶，并测定其Mr和等电点。

2006年，河南科学院生物研究所刘仲敏等以米曲霉ZLF13菌株经固态发酵生产的真菌粗α-淀粉酶制品(发酵曲)为原料，对其提纯、精制的工艺条件和保存方法进行了研究。

其最佳提纯工艺条件为:培养好的发酵曲采用40°C温水，pH值7.5左右，加水比为 1:4，浸泡3 h，压滤滤液经超滤浓缩后，在 10一15°C ,pH 6.0-6.5，与食用酒精混合为酒精体积分数为70%的溶液中静置沉析，过滤后于40℃低温鼓风干燥。

最采用该工艺条件进行粗酶提纯产品综合回收率稳定在70%以最高达到74%，产品酶活力最高达25416u/g，平均达16608u/g。

同年，湖南农业大学喻凤香等对根霉RhizopusRA-1淀粉酶进行了分离纯化，经过(NH4)2SO4分步沉淀，DEAE-纤维素离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析等3步纯化，达到了电泳纯的液化型淀粉酶带，效果极佳。

2007年，集美大学郭彩华等对进行了鲢肠道部分性质研究，采用硫酸铵沉淀、阴离子交换、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，首次分离纯化鲢肠道淀粉酶。

目前酶的分离提纯技术日益成熟，酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

以下是一些概括：
细胞破碎:机械破碎法(捣碎、研磨、匀浆等)、物理破碎法(温度差、压力差、超声波等)(多用于微生物)、化学破碎法(使用甲苯、丙酮、氯仿等有机溶剂以及特里顿、吐温等表面活性剂)和酶促破碎法等等。

酶的提取:使用盐溶液、酸溶液、碱溶液、有机溶剂等
沉淀分离:盐析沉淀.等电点沉淀.有机溶剂沉淀.复合沉淀.选择性变性沉淀离心分离：注意:离心机、离心方法、离心条件等。

过滤与膜分离:非膜过滤(粗滤、部分微滤)、膜过滤（大部分微滤、反渗透、透析、电渗析、）。

层析分离:吸附、分配、离子交换、凝胶、亲和、层析聚焦等。

电泳分离:纸电泳.薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦等。

萃取分离:有机溶剂、双水相、超临界、反胶束等。

浓缩结晶:盐析、有机溶剂、透析、等电点、温度差、金属离子等。

干燥成品:真空、冷冻、喷雾、气流、吸附等。

二、α-淀粉酶的研究现状
国内α-淀粉酶类的生产和应用 1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF-7658生产α-淀粉酶，当时只有无锡酶制剂厂独家生产。

1967年杭州怡糖厂实现了应用α-淀粉酶生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7％～10％，提高出糖率10％左右。

1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。

l979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。

与传统的酸法相
比可以提高收率10％，降低成本15％以上。

另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功并投入生产。

国外α-淀粉酶研究现状目前，除开展大量常规诱变育种工作外，国外已初步搞清了产α-淀粉酶的调控基因，探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。

将枯草芽孢杆菌重组体的基因引入生产菌株，使一淀粉酶产量提高7～10倍，并已应用于食品和制酒工业，给选育高产α-淀粉酶菌株开创了新的途径。

国内外研究机构及其主要研究方向由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。

国内有代表性的研究单位有：四川大学，主要研究α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件；江南大学，主要研究α-淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；西北大学，主要研究α-淀粉酶的变性机理以及环境对α-淀粉酶的影响；华南理工大学，主要研究α-淀粉酶的固定化和动力性质；还有华中农业大学，中国科学院沈阳应用生态研究所，天津科技大学，南开大学生命科学学院，中国农业科学院，中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种α-淀粉酶生产菌的α-淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。

国外有代表性的研究单位有：加拿大的University of British Columbia，他们对人胰腺的α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦Carlsberg实验室主要研究大麦α-淀粉酶结构域与结合位点；美国的Western Regional Research Center主要研究大麦的α-淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦α-淀粉酶
的活性位点。

三、α-淀粉酶的工业应用与前景
①面包焙烤工业，作为保鲜剂。

②淀粉的液化作用和糖化作用，α-淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。

由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。

这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α-淀粉酶淀粉酶。

③纤维脱浆，淀粉脱浆可以利用α-淀粉酶，它能有选择性的去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉。

④造纸工业，淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉。

自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，可以利用α-淀粉酶部分降解淀粉来调节。

⑤除垢剂中的应用，酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。

α-淀粉酶从1975年就被应用于洗衣粉。

α-淀粉酶对Ca2+过于敏感，在低Ca的环境下稳定性很差，这限制了α-淀粉酶在除垢剂中的应用。

并且，大多数野生型菌株所产生的α-淀粉酶对作为除垢剂原料之一的氧化剂也过于敏感。

除家用除垢剂中，这个局限可以通过增加一些工艺步骤得到改善。

最近，两家主要除垢剂酶的生产厂家Novozymes and Gcncncore International已经利用蛋白质工艺改善淀
粉酶的漂白稳定性。

他们用亮氨酸替代地衣芽孢杆菌α-淀粉酶蛋白第197位上的蛋氨酸，导致酶对氧化剂成分的抵抗能力大大增强，提高了其氧化稳定性，使酶在储存过程中的稳定性更好。

⑥制药和临床化学分析，随着生物工程的不断发展，淀粉酶的应用涉及到许多其他领域，比如临床，制药和分析化学。

α-淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。

对于高效的α-淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通过蛋白质工艺改良得到。

得益于现代生物技术的发展，α-淀粉酶在制药方面的重要性日益凸显。

当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，α-淀粉酶在这些领域的需求仍然是最大的。

α-淀粉酶的研究将趋向于特定领域，在酶工程、基因工程、蛋白质工程等领域依然有广阔的前景，更加专一的α-淀粉酶也将会大规模地出现，比如耐高温、耐酸、耐碱等。

四、总结
α-淀粉酶在催化淀粉的水解过程中发挥着巨大的作用，不仅如此，它更具有强大的科研价值、商业价值、生态价值，将会更有效率地服务于人类！
五、资料来源与参考文献（系统列出）
1、维普资讯：/
2、万方数据库：/
3、CNKI资源总库：/
4、生物信息网：/
5、维基百科：/
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7、孔显良王傻英崔雅洁姜面萍等《米曲霉6-193α-淀粉酶的纯化和性质的研究》（《微生物学报》第31卷第4期，1991）
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11、景娟侯铁舟赵东方王英阮梅生等《高效疏水色谱分离不同龋敏感者唾液α-淀粉酶》（《口腔医学》第24卷第5期，2004）
12、龚振华肖现民徐绍英张祥民等《胰胆合流异常胆汁和血清淀粉酶的二维电泳》（《复旦学报》（医学版）第32卷第1期，2005）
13、刘仲敏郭士军薛永梅张新武刘安邦等《真菌α-淀粉酶制剂的提纯与保存方法》（《食品与发酵工业》第32卷第1期，2006）
14、喻凤香陈煦林亲录李珂杨熠李菁等《根霉淀粉酶的分离纯化及部分性质研究》（《酿酒》第33卷第4期，2006）
15、郭彩华张希春卢珍华郑彩梅等《鲢肠道淀粉酶的分离纯化及部分性质研究》（《淡水渔业》第37卷第3期，2007）
16、孙晓菲李爱江等《α-淀粉酶的应用与研究现状》（《专论与综述》第6期，2008）。