菌液制备标准操作规程

一、目的：
建立方法适用性检查用菌、阳性对照菌及验证用菌的制备及使用标准操作规程，为操作人员提供正确的操作规程。

二、范围：
使用于供试品无菌检查及方法适用性试验，微生物限度检查及方法适用性试验，培养基适用性检查等所用菌液的制备。

三、职责：
微生物实验室人员。

四、内容：
1、简述:
1.1、试验环境：应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内或生物安全柜中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

1.2、操作室的清洁与消毒应依照《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。

2、设备及仪器:
2.1、阳性对照室
2.2、生化培养箱
2.3、压力蒸汽灭菌器
2.4、微波炉
2.5、玻璃器皿:锥形瓶、培养皿（90mm）、试管及塞、刻度吸管（0.1ml、1ml、5ml、10ml）锥形瓶等用前应洗涤干净。

刻度吸管口上端距0.5㎝处塞约2㎝的适宜疏松棉花，灭菌备用。

2.6、用具:接种环（铂金或镍铬合金，环径4～5㎜、长度6～10㎝）
3、试液：
3.1、消毒液: 0.1%苯扎溴铵溶液、0.1%醋酸氯已定溶液、CLBⅡ型消毒溶液（规格：0.65g/片）、75%乙醇溶液、杀孢子剂。

消毒液配制按《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。

3.2、试验用液: 0.9％无菌氯化钠溶液、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。

试验用液配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。

4、培养基: 胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基。

培养基配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。

5、菌种：所用的菌种传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代,一般使用2～5代的菌种），具体如下：
金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕
大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕
铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕
乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50 094〕
生孢梭菌〔CMCC（B）64 941〕
枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕
白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕
黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕
6、菌液制备:
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假胞单菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草
芽孢杆菌的新鲜斜面培养物至胰酪大豆胨液体培养基中；接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～72小时，观察上述培养物如生长良好，无菌分装约3ml/管（生孢梭菌上层加约1ml液状石蜡隔绝空气，造成厌氧环境），并取1管（其余至4～6℃冰箱冷藏保存，铜绿假胞单菌室温保存，在有效期内使用）用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液，采用10倍级系列稀释法制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上（一次可做多管），20～25℃培养5～7天，每管加入3～5 ml含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的0.9%的无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至一无菌试管内，无菌分装约2ml/管，并取1管（其余至4～6℃冰箱冷藏保存，在有效期内使用）用含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的0.9%的无菌氯化钠溶液采用10倍级系列稀释法制成每1ml含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

菌悬液菌落计数：取金黄色葡萄球菌、铜绿假胞单菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌适宜稀释级的菌悬液各1 ml，分别注入直径90mm的无菌平皿中，立即倾注15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置平皿，30～35℃培养48小时后计数。

取生孢梭菌适宜的菌悬液1 ml注入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基的厌氧层，30～35℃，培养24～48小时后计数。

取白色念珠菌菌悬液，黑曲霉孢子悬液各1 ml，分别注入直径90mm的无菌平皿中，立即倾注15～20ml温度不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基，混匀，凝固，倒置平皿，20～25℃培养72小时后计数。

7、注意事项：
在菌悬液系列稀释时,吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm反复吸吹约10次,每次换一支吸管(黑曲霉操作时应关掉风机在负压超净台内操作)，吸液时,应先吸至高于吸管上部刻度少许,然后提起吸管,贴于试管内壁调整液量至刻度,再沿第2级
稀释管的内壁靠近液面(勿接触液面)缓慢的吹出全部供试液(吸管内应无粘附或残留液体),然后将吸管放入消毒液内消毒。

五、变更历史：。