酶分子改造的方法及应用

酶分子改造的方法及应用摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。

通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。

近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。

随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。

关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。

虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。

在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。

在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。

所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。

1.酶分子改造的方法1.1酶分子修饰酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。

酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。

1.1.1酶分子的主链修饰酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。

1.1.1.2主链的切断修饰[3]主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。

酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。

这样可以提高药用酶的使用价值。

主链断裂有利于酶活性中心的形成，可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。

1.1.1.3主链的连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。

在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。

通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。

1.1.2酶的侧链基团修饰[4]采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。

其意义在于（1）可以研究各基团在酶分子中的作用，并用于研究酶的活性中心的必需基团。

（2）可以测定某一种基团在酶分子中的数量。

（3）可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，以提高酶的使用价值。

（4）可能获得自然界原来不存在的新酶种。

例如，某些抗体酶和人工改造的核酸类酶等。

1.1.3 酶的组成单位置换修饰酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。

酶RNA的基本组成单位是核苷酸，将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换修饰。

通过酶的组成单位置换修饰[5]，可以提高酶活力、增加酶的稳定性或改变酶的催化专一性，常用的技术为定位突变。

1.1.3.1定点突变技术定点突变 [6](site directed mutagenesis)是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。

定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下：(1)新酶分子结构的设计(2)突变基因碱基序列的确定(3)突变基因的获得：根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，合成引物，通过PCR技术获得所需基因。

1.1.3.2盒式突变技术1985年Wells[7]提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体。

利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。

这样一次处理就可以得到多种突变型基因。

1.1.4酶分子的其他修饰方法1.1.4.1金属离子置换修饰[8]有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。

若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性；若进行金属离子置换，可能提高酶的活力或增加酶的稳定性。

1.1.4.2酶分子的物理修饰[9]通过各种物理方法（高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒境）使酶分子的空间构象发生某些改变，而改变酶的某些特性和功能，从而提高酶的催化活性，增强酶的稳定性或改变酶的催化动力学特性的方法。

酶分子物理修饰的特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变。

只是使副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。

1.2酶的蛋白质工程[10]蛋白质工程(protein engineering)是以蛋白质的结构规律及其生物功能烦人关系为基础，通过基因重组技术改造或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。

1.2.1蛋白质工程的基本流程首先利用传统蛋白质纯化方法纯化目标蛋白质，测定它的三维空间结构，并进行稳定性、催化活性等蛋白质功能分析；在建立蛋白质三维结构模型基础上，进行蛋白质分子设计，确立突变位点或区域并预测突变后蛋白质的结构与功能；在明确突变位点或蛋白质序列改变的区域后，对负责突变体编码基因进行构建；实验分析突变后蛋白质的功能，检测是否与原来的预测相符合。

1.2.2蛋白质工程的方法以重组DNA 技术为核心的基因工程技术改造蛋白质，还有定位诱变技术（即定点突变技术）、盒式突变技术以及重叠延伸PCR 技术。

1.3生物酶的人工模拟与普通化学催化剂相比，酶具有高效的催化活性、高度的反应专一性和反应条件温和的优点，但在实际应用时存在不稳定以及来源有限等问题。

为了得到活性高、稳定性好、价格低廉的酶，人们通过基因工程、蛋白质工程等对现有的酶进行改造，寻找新酶。

另外，在酶的结构与功能、酶对底物的分子识别和酶的生物进化等研究过程中，也需要设计简单的酶模型来模拟天然酶，开始酶的模拟。

模拟酶是根据酶的催化机制，利用有机化学、生物化学等方法，设计合成一些较天然酶简单的非蛋白质或蛋白质分子，也称人工酶。

1.3.1抗体酶抗体酶又称催化抗体，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力相结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的催化活性，是一种新型人工酶。

迄今为止，产生抗体酶的方法有两种：①以反应过渡态类似物（小分子）作为半抗原，然后让动物免疫系统产生针对半抗原的具有催化活性的抗体；②通过化学修饰、点突变以及基因重组技术将催化基因直接引入抗体的结合部位。

1.3.2印迹酶自然界中，分子识别在生物体，如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相结合的部位的高特异性。

为获得这样的结合部位，科学家们应用环状小分子或冠状化合物（如冠醚、环糊精、环芳烃等）来模拟生物体系。

如果以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子去除后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的蛋白质工程的基本流程空穴。

如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对钥匙具有识别作用。

这种技术被称为分子压印技术，又称生物压印技术。

印迹酶包括分子印迹酶和生物印迹酶。

2.酶分子的应用2.1医药领域[11]据《左传》记载，我们的祖先在2500多年前，就懂得利用麦麹治病，实质上是利用在谷物中生长的各种微生物所产生的酶类进行疾病治疗。

1894年，日本的高峰让吉从米曲霉中制得淀粉酶，用于治疗消化不良。

20世纪后半叶，生物科学和生物工程飞速发展，酶在医药领域的应用越来越广泛。

在医药领域使用的酶具有种类多、用量少、效率高等特点。

2.1.1用酶进行疾病的诊断通过酶的催化作用测定体内某些物质的含量变化，或者通过体内原有酶活力的变化情况进行疾病诊断的方法叫做酶学诊断。

2.1.1.1根据体内酶活力的变化诊断疾病一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。

当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。

通过酶活力变化诊断疾病2.1.1.2用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病用酶测定物质的量的变化诊断疾病2.1.2用酶进行疾病预防和治疗用于预防和治疗疾病的酶称为药用酶，药用酶具有疗效显著、副作用小等特点。

酶在疾病预防和治疗方面的应用2.1.3用酶制造药物2.1.3.1用无色杆菌蛋白酶制造人胰岛素无色杆菌蛋白酶可以特异性地催化胰岛素B链羧基末端上的氨基酸置换反应，由猪胰岛素（Ala30）转变为人胰岛素（Thr30）,以增加疗效。

2.1.3.2用β-葡萄糖苷酶制造抗肿瘤人参皂苷人参皂苷是人参的主要有效成分，其中人参皂苷Rh1和Rh2能够抑制癌细胞生长和增值，具有抗肿瘤的功效，尤其人参皂苷Rh2的抗肿瘤功效最为显著。

人参皂苷Rh2属于人参二醇皂苷，如果将糖基改变，就可能从其它人参二醇皂苷制造得到所需的人参皂苷Rh2。

首先，将人参二醇皂苷经过水解，去除它们在C-20位置上的糖链，就可获得人参皂苷Rg3。

人参皂苷Rg3在β-葡萄糖苷酶的催化作用下，水解去除C-3位置上糖链的末端葡萄糖残基，就可获得所需的人参皂苷Rh2。

2.2其他领域食品领域：保鲜、增味，生产淀粉类、蛋白质类食品，对果蔬类食品进行加工。

如溶菌酶，可以杀灭食品中的细菌，以达到防腐保鲜的效果。

工业领域：生产工业产品，处理工业原料，增强产品使用效果。

如木质素酶，水解除去造纸原料纤维中的木质素，不但可提高纸的产量，而且大大减轻环境污染程度。

农业领域：对农产品进行保鲜、加工及质量检测，生产饲料。

如胆碱酯酶，利用其活性变化，可检测农产品是否受到有机磷农药污染。

环保、能源领域：环境监测，废水处理，生产可生物降解材料、生物柴油、氢气。

如利用乳酸脱氢酶的同工酶监测重金属对环境的污染。

生物技术领域：去除细胞壁，进行大分子切割，分子拼接。

如限制性核酸内切酶，可识别碱基排列顺序，在特定位点进行切割。

参考文献：[1] 黎春怡，黄卓烈。

化学修饰法在酶分子改造中的应用。

生物技术通报，2011,（9）：39-43。

[2] 伍志权，黄卓烈，金昂丹。

酶分子化学修饰研究进展。

生物技术通讯，2007：869-871。

[3] 姜忠义，高蓉，许松伟，王艳强，高岩。

蛋白质和多肽类药物分子化学修饰的研究进展。

中国生化药物杂志，2002，23（2）:102-104。