间接法Elisa汇总
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题。其次还有可能是包被或封闭出了问题，那最后只能是一抗不能和抗原结合了（可
能性较小）。
2最后显色阳性、阴性、空白都有颜色，可能是，（1）阳性的显色结果是非特异结
合；（2）阴性稀释不够，或者本身阴性血清就含有可以和抗原结合的物质（动物的
个体差异造成）；（3）洗板没洗干净，可以增加洗板次数和时间，提高洗板效果。
配制量
1L
显色液
配制方法
3在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。
四、二抗
本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG
1用0.01MPBS做1:5000稀释（现用现配）。
2.100 4/孔。
3.酶标板37C孵育30min,洗板3次。
【注】：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗 就应该选择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。
3出现“跳孔”即，抗体的吸光值并不是根据稀释梯度逐级递减，可能是在做梯度
稀释的时候出现了失误（一般新手的较易出现这种情况）。
六、终止
终止液为2M的H2SO4。
100 4/孔，终止后立即用酶标仪检测，波长为450nm下记录实验结果。
分析抗体效价。
如，
稀释倍数
抗体
1:500
3.138
1:1000
2.957
dH2O定容至1L。
一抗稀释液 (封闭液) 配制量 配制方法
100ml
1.称量下列试剂。
牛血清白蛋白(BSA)
1g
吐温-20
0.05ml
0.1M PBS
10ml
2.dH2O定容至100ml。
3•注：吐温较为粘稠，用枪吸取时要多停留一会儿。
4.4 C保存。
二抗稀释液【0.01MPBS】
0.1MPBS(PH=7.2)配 己制量1L
1:2000
2.351
1:4000
1.644
1:8000
1.047
1:16000
0.611
阴性1:2万
0.096
空白
0.094
【注】：我们把抗体的吸光值大于1的稀释倍数，认定为有效加的。最接近1的那个稀释倍
数为该抗体的效价。如本图，该抗体的效价为1:16000。
我们的认定方法和教科书上规定的方法不同，但是教科书上的方法过于理想化，根
3.4 C保存。
②TMB【四甲基联苯胺】
配制量
10ml
配制方法
1.称量下列试剂。
TMB
20mg
无水乙醇
10ml
2.4 C保存。
③0.75%H2°2
配制量
400讪
配制方法
10M 30%H202+390卩1dH
2O
注：显色液混合①②③时
，现用现混。
0.75%H2O2现用现配
> 0
终止液【2M浓H2SO4】
五、显色
1.显色液参照底物配制表。
总体积
(ml)
10
8
6
4
2
A+B混合液（ml）
10
8
6
4
2
TMB
(ml)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.75%HzCb( 4)
32
25.6
19.2
12.8
6.4
2.100 4/孔。
3•酶标板37C孵育15min，不洗板，直接加终止液。
【注】：①最后显色阳性、阴性、空白都没有一点颜色，很有可能是二抗或者显色剂出了问
取出5pl加入995pl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。
4•空白对照：只加抗原稀释液。
5•除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100pl抗原稀释液。
6.第一孔加100d（1：1000）的阳性对照。
7.第二孔加100l（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100d加到3号
孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。
据普遍的各个实验室的实际经验来看，我们才采用了上述方法来判定抗体的效价。
附录1
包被液【10X CBS】
(pH9.6)配制量1L
配制方法
1.称量卜列试剂，置于
1L烧杯中。
Na2CO3
15.9g
150mM
NaHCO3
29.3g
350mM
抗原量：200ng/孔，20ug/板。
2.调节pH值至9.6,
3.4 C保存。
1：1000
1：2000
1：4000
1：8000
1：16000
1：32000
阴性对照（1:2万）
空白对照
&将酶标板37C孵育1h,洗板3次。
【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数
（一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易）。
2更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。
间接法
一、包被
1抗原包被量为20用/板。
2.例如：抗原浓度为0.8mg/ml。
3.取25d抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100』/孔。
4.包被完毕后，4C过夜。
二、封闭
1•从4C冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。
2.加封闭液，200d/孔。
3.37C孵育2h。
4.甩干，洗板（3次）。
5.用干燥的自封袋4C保存。
配制方法1•称量下列试剂。
NaH2PO4•2H2O
2.83g
Na2HPO4•12H2O
28.98g
NaCl
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ85g
2•调节pH值至7.2，dH2O定容至1L。
3.常温保存。
①A+B混合液
配制量 配制方法
50ml
1•称量下列试剂。
柠檬酸(A)
0.47g
Na2HPO4•12H2O(B)
0.73g
2.dH2O定容至50ml。
【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200d -300 d洗板液，静置2min，甩出，将板拍在 干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。
三、一抗
1•可洗板一次。
2•阳性对照：1pl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1:1000稀释（第一孔）。
3•阴性对照：做1:2万稀释。
用1pl阴性血清加入100pl抗原稀释液中，先做1:100稀释。再从此液
能性较小）。
2最后显色阳性、阴性、空白都有颜色，可能是，（1）阳性的显色结果是非特异结
合；（2）阴性稀释不够，或者本身阴性血清就含有可以和抗原结合的物质（动物的
个体差异造成）；（3）洗板没洗干净，可以增加洗板次数和时间，提高洗板效果。
配制量
1L
显色液
配制方法
3在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。
四、二抗
本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG
1用0.01MPBS做1:5000稀释（现用现配）。
2.100 4/孔。
3.酶标板37C孵育30min,洗板3次。
【注】：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗 就应该选择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。
3出现“跳孔”即，抗体的吸光值并不是根据稀释梯度逐级递减，可能是在做梯度
稀释的时候出现了失误（一般新手的较易出现这种情况）。
六、终止
终止液为2M的H2SO4。
100 4/孔，终止后立即用酶标仪检测，波长为450nm下记录实验结果。
分析抗体效价。
如，
稀释倍数
抗体
1:500
3.138
1:1000
2.957
dH2O定容至1L。
一抗稀释液 (封闭液) 配制量 配制方法
100ml
1.称量下列试剂。
牛血清白蛋白(BSA)
1g
吐温-20
0.05ml
0.1M PBS
10ml
2.dH2O定容至100ml。
3•注：吐温较为粘稠，用枪吸取时要多停留一会儿。
4.4 C保存。
二抗稀释液【0.01MPBS】
0.1MPBS(PH=7.2)配 己制量1L
1:2000
2.351
1:4000
1.644
1:8000
1.047
1:16000
0.611
阴性1:2万
0.096
空白
0.094
【注】：我们把抗体的吸光值大于1的稀释倍数，认定为有效加的。最接近1的那个稀释倍
数为该抗体的效价。如本图，该抗体的效价为1:16000。
我们的认定方法和教科书上规定的方法不同，但是教科书上的方法过于理想化，根
3.4 C保存。
②TMB【四甲基联苯胺】
配制量
10ml
配制方法
1.称量下列试剂。
TMB
20mg
无水乙醇
10ml
2.4 C保存。
③0.75%H2°2
配制量
400讪
配制方法
10M 30%H202+390卩1dH
2O
注：显色液混合①②③时
，现用现混。
0.75%H2O2现用现配
> 0
终止液【2M浓H2SO4】
五、显色
1.显色液参照底物配制表。
总体积
(ml)
10
8
6
4
2
A+B混合液（ml）
10
8
6
4
2
TMB
(ml)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.75%HzCb( 4)
32
25.6
19.2
12.8
6.4
2.100 4/孔。
3•酶标板37C孵育15min，不洗板，直接加终止液。
【注】：①最后显色阳性、阴性、空白都没有一点颜色，很有可能是二抗或者显色剂出了问
取出5pl加入995pl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。
4•空白对照：只加抗原稀释液。
5•除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100pl抗原稀释液。
6.第一孔加100d（1：1000）的阳性对照。
7.第二孔加100l（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100d加到3号
孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。
据普遍的各个实验室的实际经验来看，我们才采用了上述方法来判定抗体的效价。
附录1
包被液【10X CBS】
(pH9.6)配制量1L
配制方法
1.称量卜列试剂，置于
1L烧杯中。
Na2CO3
15.9g
150mM
NaHCO3
29.3g
350mM
抗原量：200ng/孔，20ug/板。
2.调节pH值至9.6,
3.4 C保存。
1：1000
1：2000
1：4000
1：8000
1：16000
1：32000
阴性对照（1:2万）
空白对照
&将酶标板37C孵育1h,洗板3次。
【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数
（一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易）。
2更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。
间接法
一、包被
1抗原包被量为20用/板。
2.例如：抗原浓度为0.8mg/ml。
3.取25d抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100』/孔。
4.包被完毕后，4C过夜。
二、封闭
1•从4C冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。
2.加封闭液，200d/孔。
3.37C孵育2h。
4.甩干，洗板（3次）。
5.用干燥的自封袋4C保存。
配制方法1•称量下列试剂。
NaH2PO4•2H2O
2.83g
Na2HPO4•12H2O
28.98g
NaCl
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ85g
2•调节pH值至7.2，dH2O定容至1L。
3.常温保存。
①A+B混合液
配制量 配制方法
50ml
1•称量下列试剂。
柠檬酸(A)
0.47g
Na2HPO4•12H2O(B)
0.73g
2.dH2O定容至50ml。
【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200d -300 d洗板液，静置2min，甩出，将板拍在 干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。
三、一抗
1•可洗板一次。
2•阳性对照：1pl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1:1000稀释（第一孔）。
3•阴性对照：做1:2万稀释。
用1pl阴性血清加入100pl抗原稀释液中，先做1:100稀释。再从此液