色谱基础知识及原理
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30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
关于色谱
色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析 仪器 常见的分离方式：
蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等
色谱
是其中一种分离工具
色谱法简介
色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献
1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography
以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色 谱条件
评价液相色谱方法的标准
问题：什么样的分离结果是好的？分离度？
什么是色谱的分离度
分离度的公式：
R V2 V1
1 2
(W2
W1 )
R：分离程度的量度
影响分离度的因素：K’、α及N
分离度方程：
R
k' k'
1
1
N 4
K‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料
液相色谱图相关术语
峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰 － Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
液相色谱图相关术语
死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间
保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
死体积，V0 － Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
液相色谱应用：制备型液相色谱
分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
液相色谱应用：分析型液相色谱
定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域
定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器
0
2000
4000
理论塔板数
6000
8000
塔板数 × 103
塔板数与流速的关系
15
10
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
流速（cm/min）
分离度与 N 的关系
N 塔板数
N结果
% 变化
N 1000 N 2000 N 3000
N 5,000 N 10,000 N 15,000
液相色谱图相关术语
基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线
基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动
谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象
1000 31.6 2000 44.7 3000 54.7
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
HPLC的仪器配置及流程
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
HPLC的仪器配置及流程
数据处理系统
峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相 交两点之间的距离
对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用
液相色谱原理 － 基本概念及方法开发
液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
溶剂 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
液相色谱图相关术语
色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分 曲线
N 1600
PW = 2
N
16
V
2
W
N
16
5
2
2
N 100
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
N
s
V1
2
W
W
s
方法
Wtan
16 切线法
Wh
5.54 半峰高
W3s
9
3s
W4s
16
4s
W5s
25
5s
峰宽（L）
峰宽与塔板数的关系
300
250
200
150 100
50
k ＝ 2，Vo ＝ 1000L
什么是液相色谱
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相
高效液相色谱 HPLC
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：
之间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好 坏程度，是化学因素
N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度
分离度方程解析：柱效项
N R
1 4
1
1
Biblioteka Baidu
若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?
N ＝ 理论塔板数：分离效率的量度
PW = .5
N
16
V
2
W
N
16
5
2
.5
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
关于色谱
色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析 仪器 常见的分离方式：
蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等
色谱
是其中一种分离工具
色谱法简介
色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献
1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography
以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色 谱条件
评价液相色谱方法的标准
问题：什么样的分离结果是好的？分离度？
什么是色谱的分离度
分离度的公式：
R V2 V1
1 2
(W2
W1 )
R：分离程度的量度
影响分离度的因素：K’、α及N
分离度方程：
R
k' k'
1
1
N 4
K‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料
液相色谱图相关术语
峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰 － Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
液相色谱图相关术语
死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间
保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
死体积，V0 － Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
液相色谱应用：制备型液相色谱
分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
液相色谱应用：分析型液相色谱
定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域
定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器
0
2000
4000
理论塔板数
6000
8000
塔板数 × 103
塔板数与流速的关系
15
10
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
流速（cm/min）
分离度与 N 的关系
N 塔板数
N结果
% 变化
N 1000 N 2000 N 3000
N 5,000 N 10,000 N 15,000
液相色谱图相关术语
基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线
基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动
谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象
1000 31.6 2000 44.7 3000 54.7
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
HPLC的仪器配置及流程
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
HPLC的仪器配置及流程
数据处理系统
峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相 交两点之间的距离
对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用
液相色谱原理 － 基本概念及方法开发
液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
溶剂 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
液相色谱图相关术语
色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分 曲线
N 1600
PW = 2
N
16
V
2
W
N
16
5
2
2
N 100
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
N
s
V1
2
W
W
s
方法
Wtan
16 切线法
Wh
5.54 半峰高
W3s
9
3s
W4s
16
4s
W5s
25
5s
峰宽（L）
峰宽与塔板数的关系
300
250
200
150 100
50
k ＝ 2，Vo ＝ 1000L
什么是液相色谱
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相
高效液相色谱 HPLC
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：
之间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份分离的好 坏程度，是化学因素
N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度
分离度方程解析：柱效项
N R
1 4
1
1
Biblioteka Baidu
若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?
N ＝ 理论塔板数：分离效率的量度
PW = .5
N
16
V
2
W
N
16
5
2
.5