细胞膜毒性检测方法概括
细胞毒性测试技术及其应用
细胞毒性测试技术及其应用随着生物技术的发展，细胞毒性测试技术及其应用在现代医学和生物科学研究中变得越来越重要。
细胞毒性测试技术可以用于评估潜在药物和化学物质的毒性，以及研究有毒因素对人类和动物细胞的影响。
在良好的细胞毒性测试技术的帮助下，我们可以更好地评估新药物的安全性，也可以更好地了解环境毒性的影响，从而提高人类的健康和康复。
细胞毒性测试技术通常需要使用体外培养的细胞作为实验对象，这样可以提供一种监测有毒物质对健康细胞的影响的方法。
通常使用这种技术的实验对象包括靶细胞、捕获细胞和死细胞。
靶细胞和捕获细胞通常是用来评估化学物质或赋形物的活性的。
而对于死细胞，我们通常使用其来评估细胞毒性的程度。
目前有许多不同的细胞毒性测试技术可供使用，它们包括模式细胞培养系统、活细胞成像技术、细胞色素C释放技术和细胞取代技术。
尽管每种测试技术都有其独特的方法和限制，但它们都通过评估细胞受损的程度来帮助我们评估毒性。
人们通常使用化学染料、感光荧光物质和尺寸标记高分子作为评估细胞死亡的指示器。
这些指示器能够捕获有毒物质与细胞的相互作用和破坏的过程。
同时，还可以评估有毒物质在细胞中引起的 DNA 损伤、产生的耐药性和毒性的毒剂浓度等方面的影响。
随着技术的发展，细胞毒性测试逐渐走向自动化，这样可以更快地评估大量的样本。
一些高通量的技术可用于同时评估数百个样品。
电路板阵列也可以被用于支持大规模的测试，在该测试中，无数的细胞被固定在唾液口器中，并可由支持设备控制，以提高测试效率和准确度。
细胞毒性测试技术的应用非常广泛，包括药物和化学物质筛选、毒性评估和环境风险评估。
例如，可以用细胞毒性测试来评估一些重金属如镉的危险性，或者用于测试某些新药物的可能的毒性，以保障人类和动物安全。
总之，细胞毒性测试技术是一种重要的生物学研究方法，在科学界中不断得到广泛的应用。
通过使用这种高效准确的技术，我们可以更好地了解不同的化学物质和药品的毒性，保障我们自身的安全和健康。
医用无菌敷料细胞毒性的检验方法
细胞杀伤事件， 不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机 全要求也在不断提高。随着产品种类的增多，各种功
理。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改 能的增加， 通过适当的体外试验方法来加强其生物
变来进行的检测。 四唑盐（ MTT） 比色法是细胞毒性 安全性的控制与保障显得格外重要。
检测常用方法之一，利用线粒体内部酶的活性，可以 １ 材料与方法
细胞株：NCTC 克隆 929（ L929） ，由中国科学院 上海生命科学研究院细胞资源中心引进。
（ 3） 供试样品 医用无菌敷料： 南昌华康医疗科技有限公司
（ Ⅱ型，批号：2012042901；Ⅲ型，批号：2012042901） 1.2 方法 （ 1） 浸提介质 含血清 DMEM 细胞培养基。 （ 2） 对照样品 阴性对照：高密度聚乙烯浸提液。 阳性对照：5%的二甲基亚砜（ DMSO） 溶液。 空白对照：含血清 DMEM 细胞培养基。 （ 3） 样品供试液的制备方法 面积法：浸提比例 1.25cm2∶1ml。 质量法：浸提比例 0.1g∶1ml；根据不同型辅料
将特定的四唑盐类进行转化， 然后通过酶标仪进行
1.1 材料
检测。 体外细胞毒性试验方法经常用于对医疗器械
（ 1） 仪器设备
进行生物学评价， 其结果常常用于判断该器械产品
311CO2 恒 温 培 养 箱 ，Thermo 公 司 ；XDS-1B 倒
的基本生物安全性。
置显微镜，COIC 公司；BS2000S 电子天平，Sartorins
医用敷料，是包伤的基本常用器械产品，是用以 （ 北京） 有限公司；MULTISKAN GO 酶标仪，Thermo
覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料。随着对创面愈 公司；全自动立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有
细胞毒性的检测
细胞毒性的检测实验三、细胞毒性的检测一、实验材料及设备培养箱、雷杜RT-6100酶标仪、移液器（THERMO）、枪头、吸管、96孔板、盐水、PBS、1640培养液、离心管、血球计数板、CCK-8（日本同仁）二、实验步骤1、在96孔板中配置100微升的细胞悬液。
将培养板在培养箱中预培养24小时（37℃,5% CO2）（注：贴壁细胞最小的接种量为10000个/孔，细胞数目由血球计数板中计算得来，若计数时浓度太大，可以先稀释一定倍数取融合度为90%左右的细胞，吹打均匀，取样计数一般细胞接种后贴壁大约需要2~4小时，但是不同类型的细胞所需要的时间有差异，根据实验情况而定细胞悬液一定要混匀，培养基周围容易挥发，为减少误差，建议培养板的四周只加培养基，而不作为检测孔）。
2、向培养板加入10微升不同浓度的待测物质。
在培养箱中孵化一段时间。
（6、12、24、48，时间根据OD值来选择，OD值在1.0~2.0都可以，最好在1.0附近比较好，时间根据细胞周期来定，起码要一代以上的时间）3、向每孔加入10微升CCK-8溶液，加完后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
【注：每孔培养基体积的10%加入CCK-8，注意不要在孔中形成气泡，他们会影响OD值得读数。
如果待测物质有氧化或者还原性的话，或者细胞培养时间较长使得培养基颜色或者pH发生变化的话，可以在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞俩次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
斜贴壁加CCK-8,不要插到培养基下，容易产生气泡，干扰读数，而且速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加后要轻轻地振荡培养板使试剂和培养基充分混合，可以将CCK-8用培养基稀释一倍，混匀后每孔加20uL使用】4、将培养板在培养箱内孵育1~4小时。
（细胞不同形成的甲臜的量也不同，如果显色不够的话，可以继续培养，以确定最佳条件建议BEL-7402 2h，）。
5、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
污染生态学
一、名词解释：1、生物富集系数：生物富集系数是生物组织（干重）中化合物的浓度和溶解在水中的浓度之比，也可以认为是生物对化合物的吸收速率与生物体内化合物净化速率之比，用来表示有机化合物在生物体内的生物富集作用大小。
生物富集系数是描述化学物质在生物体内累积趋势之重要指标。
2、亚致死效应：是评估杀虫剂功效的一个术语，指的是昆虫虽存活，但不能正常化蛹的现象，称为“亚致死效应”．这种中毒的虫子不会立刻死去，但是因为无法完成进一步发育，最终还是会被消灭。
3、持久性有机污染物：是指通过各种环境介质（大气、水、生物体等）能够长距离迁移并长期存在于环境，具有长期残留性、生物蓄积性、半挥发性和高毒性，对人类健康和环境具有严重危害的天然或人工合成的有机污染物质。
4、生态风险：是指生态系统及其组分所承受的风险，指在一定区域内，具有不确定性的事故或灾害对生态系统及其组分可能产生的作用，这些作用的结果可能导致生态系统结构和功能的损伤，从而危及生态系统的安全和健康。
生态系统受外界胁迫，从而在目前和将来减小该系统内部某些要素或其本身的健康、生产力、遗传结果、经济价值和美学价值的可能性。
5、生物监测：利用生物个体、种群或群落对环境污染或变化所产生的反应阐明环境污染状况，从生物学角度为环境质量的监测和评价提供依据。
二、简述题1、简述污染物联合毒性作用的类型答：1）独立作用，互不影响2）相加作用，综合生物学效应等于单独生物学效应之和3）协同作用，综合生物学效应大于单独生物学效应之和4）拮抗作用，综合生物学效应小于单独生物学效应之和2、简述重金属汞的生物毒性效应答：神经毒性，在汞的各种化合物中，甲基汞神经毒性最为显著。
据WHO文献显示，甲基汞进入人体后，极易透过血一脑屏障在脑中蓄积，其在脑组织中的浓度可比血中高6倍，小脑和大脑两半球受损严重，特别是枕叶、脊髓后束和末梢感觉神经，因而甲基汞中毒会出现感觉障碍、向心性视野缩小、语言障碍、听力减退、共济失调等典型症状。
细胞毒性实验
细胞毒性实验
细胞毒性实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细胞的毒性程度。
在药物研发、化学品评估、环境监测等领域中，细胞毒性实验起着至关重要的作用。
本文将介绍细胞毒性实验的原理、方法和应用。
原理
细胞毒性实验通过将待测物质暴露于不同类型的细胞培养物中，通过观察细胞
生长、代谢活性、细胞形态等指标的变化来评估毒性。
细胞毒性主要分为急性毒性和慢性毒性两种类型，分别用于评估物质对细胞的直接杀伤作用和潜在的长期影响。
方法
1. 细胞培养
首先需要选择适当的细胞系进行实验，常用的细胞系包括HEK293、HeLa、RAW264.7等。
细胞需在灭菌条件下培养，并保持在适宜的培养基中。
2. 暴露实验
将不同浓度的待测物质加入到细胞培养物中，设立对照组和实验组。
根据实验
需要，可以选择不同时间点进行观察。
3. 细胞存活率检测
通过MTT法、CCK-8法等方法检测细胞的存活率，进而评估毒性程度。
此外，也可以观察细胞形态的变化，如细胞凋亡、坏死等。
4. 数据统计分析
将实验结果进行统计分析，绘制图表，评估不同浓度下待测物质的毒性效应。
应用
细胞毒性实验广泛应用于药物筛选、化学品评估、环境毒性检测等领域，为评
估物质对细胞的毒性提供重要依据。
通过细胞毒性实验，可以及时发现有毒物质，减少对人类健康和环境的危害。
综上所述，细胞毒性实验是一种重要的实验方法，具有广泛的应用前景。
加强
对细胞毒性实验的研究和应用，对于促进科学研究和保护人类健康具有积极意义。
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。
近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。
目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。
1 单个细胞水平测定CTL活性目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。
活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。
目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。
1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。
LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。
但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。
(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。
细胞毒实验的分类、原理性检测方法与应用(医学相关)
1.1.2 Calcein-AM荧光扫描测定法 Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本
身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透 出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂 （一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对 细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液 中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞 对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。 本法简便可靠，无南收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数 据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还 可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。不足的是对某些高核浆比 的细胞染色效果不太好；Calce-in-AM在高浓度时可能损害细胞功能。
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定
细胞毒T淋巴细胞 (CTL)活性测定是研究机体细胞免疫功 能的重要方法之一。传统的51 Cr释放法虽然有效 ,但也 存在某些不足。随着荧光标记、流式细胞分析和报告基 因等技术的广泛应用 ,促进了寻找灵敏可靠、简单易行 的非同位素法测定CTL活性的方法学研究。
淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活Leabharlann 测 定补体依赖的细胞毒实验
抗原与抗体结合
+ 补体
台盼蓝染液
抗体依赖性细胞介导细胞毒实验 （ADCC）：
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指表达IgGFc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感 染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀 伤这些靶细胞的作用，是不同效应细胞群介导的杀伤性效应机 制之一。
生物毒性测量技术分析
生物毒性测量技术分析随着现代化产业的快速发展以及人类对环境的不断污染，生物毒性测量技术越来越成为环境保护领域的重要技术之一。
生物毒性测量技术是一种通过测量毒物对生物体造成的影响，来评估环境污染程度的技术手段。
本文将从生物毒性测量技术的定义、分类、应用案例和存在的问题等四个方面进行分析。
一、生物毒性测量技术的定义生物毒性测量技术，顾名思义就是通过对毒物在生物体内产生的不良反应进行测量来评估环境污染程度。
它通过对生物体代谢、生长、繁殖、免疫、感官等各方面的指标进行测定，来判断排放物对环境和生态系统的影响。
二、生物毒性测量技术的分类生物毒性测量技术通常分为四类：生物学评估方法、细胞毒性测量技术、生物标志物测量技术和生态毒性测量技术。
1、生物学评估方法：即以完整生物体为对象进行生物毒性测量的方法，适用于评估环境污染物对生物多样性的影响程度。
比如，对水体中某种重金属浓度的升高进行实验研究，以水母为实验对象，根据尾柄蠕动频率、口周吞噬活性、突起射出频率、器官功能等指标来对生物毒性进行评估。
2、细胞毒性测量技术：即以细胞作为对象进行检测的生物毒性测量方法。
它是目前应用较多、被广泛认可的方法之一，主要应用于药物毒性测试、新药开发中药效学的评价及环境化学物质污染的生物毒性评价。
在这方面，我们使用的较多的是细胞活力测定、细胞形态和器官的检测、遗传毒性、染色体畸变等指标。
3、生物标志物测量技术：生物标志物是指能够精确指示环境污染物暴露水平的某一种或几种生物分子，如肝功能酶、抗体、代谢产物等。
应用生物标志物，可以直接反映出环境污染物对生物体发生的变化，研究暴露过程及暴露剂量。
生物标志物的应用范围较广，从工人的职业健康监控、到环境污染物的预警都有应用。
4、生态毒性测量技术：它是一种从生态系统的角度对环境污染物进行评价的方法。
生态毒性测量技术包含了下列指标：有机物分解速率、灭活速率、能量流动、物种数量、环境质量等。
三、生物毒性测量技术的应用案例生物毒性测量技术被广泛应用于水质检测、大气污染检测、沉积物检测等多个环境检测场所，可用于体现各种污染物的生态和环境影响。
MTT法测细胞毒性
MTT法测细胞毒性试剂MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。
含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g浓HCl（36%）86.2 ul定容至100ml，过滤除菌方法1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔板，100ul/孔，即细胞数104/孔。
空白孔不加细胞悬液。
,37℃条件下培养24小时。
2.5%CO23.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。
阴性对照孔不加毒素。
,37℃条件下培养72小时。
4.5%CO25.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml，37℃条件下培养4小时。
6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30分钟。
7.酶标仪上测定A570。
8.计算细胞死亡率：细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100%注意1．细胞数范围：（0.5~2）×104。
2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。
3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。
4．设置空白与对照空白孔：——+——+MTT+有机溶剂对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。
用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。
生物学在药物安全性评估中的应用
生物学在药物安全性评估中的应用药物安全性评估是一项非常重要的工作，它对新药的上市以及现有药物的使用提供了关键性的参考依据。
而在药物安全性评估中，生物学的应用发挥着至关重要的作用。
本文将探讨生物学在药物安全性评估中的应用，并重点介绍动物实验、细胞毒性测试和基因毒性评价三个方面。
一、动物实验动物实验是药物安全性评估中最常用的方法之一。
通过在动物身上进行实验，可以评估药物的毒性和副作用，为人类使用提供参考。
常见的动物实验包括急性毒性试验、亚慢性毒性试验和生殖毒性试验等。
急性毒性试验主要评估药物对动物的短期毒性作用，通常使用小鼠、大鼠或兔子等常见实验动物进行，观察其死亡率、临床症状、体重变化等指标，以确定药物的安全剂量范围。
亚慢性毒性试验则通过长期（通常为90天）给予动物不同剂量的药物，观察其对器官、组织和生理功能的影响。
这种试验可以更全面地评估药物的安全性，并检测出潜在的亚慢性毒副作用。
生殖毒性试验主要关注药物对生殖系统和胚胎发育的影响，可以评估药物的生殖毒性和致畸性。
常见的指标包括动情期、受孕率、胚胎发育异常等。
二、细胞毒性测试细胞毒性测试是药物安全性评估中的另一个重要环节。
通过在细胞水平上评估药物对细胞的毒性和损伤情况，可以预测其对人体的潜在危害。
常用的细胞毒性测试方法包括MTT法、LDH释放试验和细胞增殖抑制试验等。
MTT法是一种常见的细胞毒性测试方法，通过测量细胞内还原MTT为紫色产物的能力来评估细胞活力。
药物对细胞生长的影响可以通过测量紫色产物的光学密度来判断，从而评估药物的毒性程度。
LDH释放试验评估药物对细胞膜完整性的影响。
当细胞膜受损时，细胞内的LDH会释放到培养基中。
通过测量培养基中的LDH含量，可以判断细胞膜的完整性和细胞毒性。
细胞增殖抑制试验主要用于评估药物对细胞增殖的抑制作用，可以通过测量细胞数目、活力或DNA含量等指标来评估药物的毒性。
这种测试方法尤其适用于抗肿瘤药物的评价。
用于药物筛选的细胞毒性测定方法总结
用于药物筛选的细胞毒性测定方法总结简介药物筛选是新药研发过程中的重要环节之一。
细胞毒性测定方法是评估药物候选的安全性和毒性的常用手段。
本文档总结了常见的用于药物筛选的细胞毒性测定方法，并对其原理和应用进行了简要介绍。
细胞毒性测定方法1. MTT法MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是一种常用的细胞毒性测定方法。
该方法通过测定细胞内还原MTT为紫色形成的甲基蓝晶体的量来评估细胞的生存率。
MTT法简便、快速，适用于评估化学物质对细胞的毒性。
2. SRB法SRB（sulforhodamine B）法也是一种常见的细胞毒性测定方法。
该方法利用SRB染色与细胞蛋白质结合来评估细胞的生存率。
SRB 法具有操作简便、结果稳定的特点，广泛应用于药物筛选领域。
3. LDH法LDH（lactate dehydrogenase）法是衡量细胞膜完整性的常用方法之一。
该方法通过测定培养上清液中乳酸脱氢酶的活性来评估细胞膜的破坏程度。
LDH法对细胞毒性的灵敏度高，适用于评估药物的细胞毒性。
4. ATP酶法ATP酶法是通过测定细胞内ATP酶的活性来评估细胞的生存能力的方法。
该方法适用于高通量筛选，可以同时评估大量化合物对细胞的毒性。
ATP酶法操作简单、快速，是药物筛选中常用的细胞毒性测定方法之一。
结论细胞毒性测定方法在药物筛选中扮演着重要的角色。
本文总结了常见的MTT法、SRB法、LDH法和ATP酶法，这些方法具有操作简便、结果可靠的特点，适用于评估药物候选的细胞毒性。
根据具体需求和实验条件选择合适的细胞毒性测定方法，将有助于提高药物筛选的效率和准确性。
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
细胞毒理学(2014)
研究内容
细胞毒性作用 细胞形态学观察 细胞恶性转化 细胞生物学（生长、死亡、衰老、分化） 作用机制（信号转导、细胞损伤、修复）
18
体外细胞实验的优点
细胞来源充足 条件容易控制 结果重复性好 操作简便 试验周期相对较短
19
细胞水平研究局限性
脱离了整体复杂的环境条件，其 生存环境和细胞之间的相互关系 都发生了改变，细胞生物学特性 也发生相应变化；
1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。
细胞毒性的检测方法
化学物质对细胞的毒性作用，可以表现为 细胞一系列的形态、功能以及代谢上的变 化，在损伤严重的情况下，会导致细胞的 死亡。
细胞凋亡(apoptosis)和细胞坏死 (necrosis)是两种主要的细胞死亡方式， 它们的性质和生物学意义有本质上的不同。
14
细胞功能
分子运输 DNA复制 增殖 蛋白质合成 细胞代谢 细胞信号传导
15
细胞生物学研究技术
• 显微镜观察 • 细胞培养 • 分子生物学 • 免疫组织化学 • 生物化学
16
细胞毒理学
定义：应用细胞生物学技术研究外 来有害因素作用所导致的细胞结构 上和功能上的损伤效应以及毒作用 机制的一门毒理学分支学科。
有核膜和核仁 有 复杂 微管和微丝 有丝分裂 不同时间和地点
动 物 细 胞 模 式 图
细胞膜（Cell Membranes） 细胞质（Cytoplasm） 细胞核（Nucleus）
细胞膜结构及功能
• 保护细胞 — 结构、形状 • 物质交换 — 转运物质 • 信息传递 — 如神经信号传导 • 能量交换 — 如化学能
29
两性霉素B制剂细胞毒性测定法
两性霉素B制剂细胞毒性测定法毛文学余音李欣钰余丹丹（上海研诺医药科技有限公司上海 201114）摘要目的：建立一种能够在细胞水平快速评价两性霉素B制剂细胞毒性的方法，用于产品的质量研究。
方法：以大鼠红细胞作为药物毒性评价载体，选择其红细胞中释放的K+浓度为评价指标，以高效液相色谱法（HPLC）检测K+浓度。
结果：大鼠红细胞孵育时间为4 h时，组内样品平行性良好，批间阳性及阴性对照K+释放结果重复性好，最大RSD为5.57%，符合质量要求。
结论：本方法可以精确测定出不同剂型、不同浓度、不同孵育时间红细胞释放的K+含量，并且不受其他杂质离子的干扰，可以用于快速评价两性霉素B制剂细胞毒性。
关键词两性霉素B 细胞毒性大鼠红细胞 K+浓度 HPLC中图分类号：R917; R978.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2023)13-0099-04引用本文毛文学, 余音, 李欣钰, 等. 两性霉素B制剂细胞毒性测定法[J]. 上海医药, 2023, 44(13): 99-102.Determination of cytotoxicity of amphotericin B preparationMAO Wenxue, YU Yin, LI Xinyu, YU Dandan(Shanghai DDsome Laboratories Co., Ltd., Shanghai 201114, China)ABSTRACT Objective: To establish a method that can quickly evaluate the cytotoxicity of amphotericin B pharmaceutical products at the cellular level for product quality study. Methods: Rat erythrocyte was selected as the carrier for drug toxicity evaluation, the concentration of K+ released from rat erythrocytes was used as the evaluation index and K+ concentration was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Results: When rat erythrocyte was incubated for 4 h, the sample parallelism was good, the K+ release results of positive and negative control between batches had good repeatability, and the maximum RSD was 5.57%, which met the quality requirements. Conclusion: This method can accurately determine the content of K+ released by erythrocytes in different dosage forms, concentrations and incubation time, is not interfered by other impurity ions, and can be used to quickly evaluate the toxicity of amphotericin B pharmaceutical products.KEY WORDS amphotericin B; cytotoxicity; rat erythrocytes; K+ concentration; HPLC两性霉素B（AmB）是一种多烯类广谱抗真菌抗生素，是治疗敏感深部真菌感染的首选药物之一[1-3]，但AmB的作用机制决定了其在破坏真菌细胞的同时也会导致人体正常细胞损伤，影响细胞膜的运输，长期使用还会造成肾损伤及循环系统的损伤，表现出蛋白尿、氮质血症、低血钾、贫血等症状[4]。
细胞毒性实验
细胞毒性实验细胞毒性实验是一种常见的生物学实验方法，用于评估各种物质对细胞的毒性和影响。
通过细胞毒性实验可以研究药物的安全性、环境污染物的危害性以及化学物质的毒理学特性。
本文将介绍细胞毒性实验的基本原理、常用方法以及结果的解读。
基本原理细胞毒性实验基于细胞生物学的基本原理，利用细胞在体外的培养条件下对外界刺激的反应来评估物质的毒性。
在细胞毒性实验中，通常选用肿瘤细胞株或非肿瘤细胞株作为实验对象，通过给细胞暴露于不同浓度的待测物质，观察其对细胞形态、生长、代谢等方面的影响，从而判断其毒性程度。
常用方法MTT法MTT法是一种常用的细胞毒性实验方法，通过将细胞与MTT染料反应产生紫色的甲苯胺酚盐，用来反映细胞的代谢活性，从而评估细胞的存活率。
该方法操作简单、灵敏度高，常用于筛选化合物的毒性作用。
LDH释放法LDH释放法是测定细胞膜通透性的一种方法，通过测定培养基中LDH的释放量来评估细胞的损伤程度。
在细胞受到毒性物质的作用后，细胞膜破裂导致LDH的释放，因此LDH释放量的增加可以反映细胞膜的破损情况。
结果解读在细胞毒性实验中，通常会得到一系列不同浓度下的实验数据，如细胞存活率、LDH释放量等。
通过对这些数据进行统计分析和比较，可以得出物质对细胞毒性的评估结果。
一般情况下，细胞存活率越低，LDH释放量越高，说明物质对细胞的毒性越大。
细胞毒性实验是评估化合物毒性的重要手段，通过该实验可以为药物研发、环境保护和毒理学研究提供重要参考。
科学家们不断改进细胞毒性实验的方法，提高其准确性和灵敏度，希望能够为人类健康和环境保护作出更大的贡献。
生物毒性测试的原理与方法
生物毒性测试的原理与方法生物毒性测试是一种用来检测化学物质、药物或其他物质在生物体中对细胞、组织或整个生物的毒性的实验方法。
这种测试方法的原理是通过在实验室中使用生物体，如细胞、昆虫、鱼类、啮齿动物和非人类灵长类动物等，将这些生物体暴露在被测毒素的环境下来观察和记录其反应。
本文将探讨生物毒性测试的原理和方法，并介绍一些广泛应用的毒性测试。
一、生物毒性测试的原理生物毒性测试的原理涉及多种生物学、免疫学和化学原理。
当一种物质进入生物体内时，它可能会对生物体产生两种主要的影响：急性或长期毒性。
急性毒性通常是在短时间内就会出现的反应，如头痛、恶心、呕吐、晕眩等。
长期毒性则是在长时间内才会表现出来，可能会导致肿瘤、免疫系统受损、生殖系统受损等。
采用生物毒性测试可以检测这些毒性。
生物毒性测试中最常用的测试是急性毒性测试。
一种典型的实验是将实验动物暴露在已知浓度的待测物质下并记录其反应。
这种测试可以在短时间内反应出毒性的影响，例如观察实验动物的行为、体重、食欲、皮肤损伤等。
另一种生物毒性测试是慢性毒性测试。
这种测试通常需要长时间才能得到结果。
例如，实验动物会在几周或几个月内暴露在待测试的化学物质中，然后观察它们的健康状况、免疫系统、生殖系统和其他生理状况。
这种类型的测试更加现实，因为它可以反映真实生活中长时间接触化学物质对生物体的影响。
但是，由于这种测试需要时间、金钱和资源，所以大多数情况下这种测试只会在需要更长时间判断成果的时候才会使用。
二、生物毒性测试的方法生物毒性测试方法有多种，每种方法都有其优缺点。
其中一些广泛应用的方法如下：1.微量细胞毒性测试微量细胞毒性测试是一种在体外的细胞系中进行的生物毒性测试。
在这种测试中，待测物质会加入到细胞培养物中，并通过记录细胞的生长、细胞死亡或 DNA 损伤等参数来评估其毒性。
此方法使用非常广泛，因为它比其他方法简单易行，时间较短，不需要大量的资源。
2.珍珠毒性测试珍珠毒性测试是利用腾腾框体粒子的珠重和色泽进行评估急性毒性。
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首先，可进行细胞的毒性检测，通过台盼蓝拒染法检测细胞存活率变化，MTT或WST法检测细胞的活力。
其次，细胞功能的正常有赖于膜结构的完整及膜特性的保持，所以通过以下方法检测某种物质对细胞膜的毒性
1.细胞膜通透性的变化：
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于生物细胞内，是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。
当细胞受损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可泄漏至细胞外介质中。
泄漏出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I 变成还原型辅酶I，通过测定NADH在340 nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力，从而得到细胞膜是否损伤的结果。
国外有通过试剂盒检测腺苷酸激酶的释放以及通过共聚焦激光扫描显微镜检测碘化丙啶的吸收量。
检测膜胆固醇采用邻苯二甲醛比色法。
测定波长为510 nm，按照试剂盒说明检测。
2.可通过透射电镜观察细胞膜结构及以PI为荧光染料检测核膜完整性，现在更有利用原子力学显微镜（AFM）观察细胞的形态结构及比较细胞表面粘弹力的变化，比较药物对细胞膜作用前后的膜表面结构变化。
利用AFM的力曲线得到能表明机械性能参数的粘弹力来分析比较未作用药和作用药后的细胞，一般，作用药组细胞其弹性小于未作用药细胞。
3.细胞膜表面整合素的变化：
整合素是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白，由α和β两个亚基以非共价键连接的异二聚体，目前发现由19种α亚基和8种β亚基以不同方式组合形成24种整合素亚型。
用流式细胞仪检测细胞表面整合素(integrinpl)的表达(平均荧光强度）
4.Western blot检测细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β
细胞骨架是由蛋白质纤维构成的胞内网络，相当于细胞的骨骼，支持着整个细胞，它紧贴在细胞膜下，赋予细胞一定的形状,对细胞及细胞器的运动也起着至关重要的作用。
应用流式细胞仪检测细胞内F-actin和tubulin-β蛋白表达的情况（通过平均荧光强度来体现）。
一般，药物作用后，使细胞内的钙离子浓度升高，引起一定的信号转导，破坏actin网络，使F-actin解聚，影响到细胞骨架结构对细胞形态的支持作用，造成细胞收缩，形态异常，细胞连接松散，易脱落，细胞生长稀疏，故在倒置荧光下观察药物作用后，细胞数目明显减少。
5.细胞膜Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP酶活性的测定
按照试剂盒的方法进行，测定Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP 酶活性。
6.细胞膜膜电位的变化：DIBAC4(3)为膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,利用它可以快速检测膜电位的动态变化，且不损伤细胞。
当DIBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化变化；反之，荧光减弱，表明细胞膜电位负值增大，出现超级化变化细胞的去极化与细胞损伤密切相关，造成大量Na+内流,K+外流，细胞内呈高钠低钾状态，细胞膜皱缩。
7.细胞膜流动性的变化：用脂质扩散系数和荧光恢复率作为评价膜流动性的指标。
参见吴秋云等:《不同粒径纳米二氧化硅的体外细胞膜毒性作用》。
8.通过对细胞膜抗氧化功能的检测：包括膜谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的变化及细胞内活性氧（ROS）的生成，纳米金属氧化物表面能够产生O2-,H2O2和·OH等ROS，这些ROS能够攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，导致细胞膜的破坏。
9.提取细胞膜，进行细胞膜SDS-PAGE分析，细胞膜大部分功能主要是由组成膜的蛋白质完成，在膜中蛋白质的种类和数量反映了膜的功能。
膜蛋白是一类结构独特的蛋白质，担负着各种各样的重要功能：如细胞的运输和细胞膜内外信号的传递及能量转换。
此外，细胞膜结构的完整性和稳定性与膜蛋白有密切关系。
10.膜唾液酸的测定：唾液酸（sialic acid，简称SA）是一族神经氨酸衍生物，广泛分布于多种生物组织中，是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分。
由于SA带负电荷，普遍存在于细胞膜表面，是细胞膜负电荷的主要来源。
它参与细胞表面的多种生理功能，如细胞分化、恶性细胞的迁移、细胞的识别、粘着和接触抑制等。
SA也是膜上受体的成份之一。
膜上SA含最减少是膜结构损伤的一个标志之一。
SA 在氧化剂存在的情况下与5-甲基苯二酚形成紫红色络合物，通过测定
络合物吸光度与标准即可计算出SA的含量。