酶的固定化
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
酶固定化技术的方法
酶固定化技术的方法
酶固定化是将酶与载体物质结合在一起，以增强酶的稳定性和重复使用性的技术。
常见的酶固定化方法包括以下几种：
1. 吸附固定化：将酶溶液与载体物质（如活性炭、陶瓷颗粒）接触，酶分子通过吸附作用与载体物质结合。
2. 凝胶固定化：将酶溶液与凝胶物质（如明胶、琼脂）混合，酶通过物理交联或化学交联与凝胶物质牢固结合。
3. 包埋固定化：将酶溶液与聚合物物质（如聚乙烯醇、明胶）混合，然后通过共混或交联反应，使酶被包裹在聚合物内部。
4. 共价固定化：将酶溶液与活性基团多的载体物质（如硅胶、纳米颗粒、聚乙二醇）反应，形成酶与载体物质之间的共价键连接。
5. 薄膜固定化：在载体表面形成一层薄膜，然后将酶与薄膜固定在一起，常见的方法有溶液浸渍、层层自组装等。
这些方法各有优缺点，选择合适的固定化方法应根据具体的酶性质、应用需求和实际操作条件进行综合考虑。
酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究
酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究标题：酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究导言：酶是生物体内非常重要的催化剂，能够加速化学反应的速率。
然而，酶在自由状态下使用存在一些限制，如易受温度、pH和抑制剂的影响等。
为了克服这些限制，研究人员开始探索酶的固定化技术，其中一种关键的固定化方法是将酶和辅酶结合起来，并寻求方法再生辅酶以提高酶的可持续使用性。
本文将深入探讨酶和辅酶的固定化方法以及辅酶再生的研究成果。
主体：1. 酶的固定化方法1.1 物理吸附固定化1.2 包埋固定化1.3 共价键结合固定化2. 辅酶的选择与固定化2.1 辅酶的种类与功能2.2 辅酶的固定化方法3. 辅酶再生的研究3.1 生物辅酶再生技术3.2 化学辅酶再生技术4. 酶和辅酶固定化的应用4.1 工业生产中的应用4.2 医学和生物技术领域的应用5. 对酶和辅酶固定化研究的观点和理解1. 酶的固定化方法酶的固定化技术是将酶通过不同的方法固定在固体载体上，以增强其稳定性和可重复使用性。
1.1 物理吸附固定化是一种简单的方法，将酶通过物理吸附作用固定在载体表面。
然而，物理吸附固定化的稳定性较低，容易受到环境因素的影响。
1.2 包埋固定化是将酶包裹在多孔载体内部，形成一种保护层，提高了酶的稳定性和抗环境因素的能力。
1.3 共价键结合固定化是通过共价键将酶与载体结合，形成较为牢固的固定化结构，提高了酶的稳定性和耐受性，但可能影响酶的活性和底物转化效率。
2. 辅酶的选择与固定化辅酶是酶催化反应过程中的辅助分子，可以与底物结合并催化其转化。
常见的辅酶包括辅酶A、辅酶NAD+等。
选择合适的辅酶并进行固定化，可以进一步提高酶的催化效率和稳定性。
2.1 不同辅酶的种类具有不同的催化功能，如辅酶A在能量代谢中起到重要作用，辅酶NAD+在氧化还原反应中起到关键作用，这些特性对选择合适的辅酶进行固定化具有指导意义。
2.2 辅酶的固定化方法包括共价键结合固定化、交联固定化等，这些方法可以使辅酶与酶固定化结构相连，提高催化效率和稳定性。
固定化酶的三种方法
固定化酶的三种方法固定化酶是把酶结合到一定的表面上，使其失去活性的过程，因此可以用来改变酶的性质、增加酶的稳定性和提高酶的反应效率。
固定化酶的三种方法是物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
一、物理化学固定化物理化学固定化是一种将未固定化酶与支架分子相互作用，使酶与支架分子结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是通过多种物理、化学或生物学方法，将酶与支架分子进行结合，从而形成一个可操作的固定化酶系统。
物理化学固定化可以大大提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，并可以改变酶的特性。
常用的物理化学固定化方法有水解结合、热结合、冷结合、电结合、化学结合、离子结合和生物结合等。
二、生物化学固定化生物化学固定化是指将酶与生物聚合物结合，使酶形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是在酶表面分子和支架分子之间形成一种亲和力，使得酶和支架分子之间形成紧密的结合。
生物化学固定化的优势在于，它可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，而且不必进行大量的实验，可以节省时间和费用。
常用的生物化学固定化方法有抗体结合法、抑制剂结合法和蛋白结合法等。
三、免疫化学固定化免疫化学固定化是一种将酶与抗体结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是将酶和抗体进行结合，从而形成一个稳定的固定化酶系统。
免疫化学固定化具有较强的特异性，可以在具有极强抗性的环境中实现高效固定化；且不仅能实现酶的固定化，还可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作。
常用的免疫化学固定化方法有免疫结合法、单克隆抗体结合法和抗体体外表达法等。
综上所述，固定化酶的三种方法是：物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
它们可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，从而更好地满足人们在实验中的需求。
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
酶和辅酶的固定化及辅酶再生研究
酶和辅酶的固定化及辅酶再生研究酶和辅酶的固定化及辅酶再生研究一、引言酶是一种生物催化剂，在生物体内起着至关重要的作用。
然而，由于酶的生物活性易受到环境条件的影响，限制了其在工业生产中的应用。
为了克服这一问题，研究人员开始利用固定化技术将酶固定在载体上，以增加其稳定性和重复使用性。
辅酶在许多酶催化反应中起着关键作用，因此辅酶再生技术也成为固定化酶研究领域的热点。
二、酶的固定化技术1. 固定化技术的基本原理固定化技术通过将酶固定在载体表面或内部，使其在催化反应中更加稳定和可控。
常见的固定化技术包括包埋法、交联法、吸附法和共价结合法等。
这些方法可以根据不同的酶和反应需求选择，以增强酶的催化活性和稳定性。
2. 固定化酶的应用固定化酶在工业生产中有广泛的应用。
在食品工业中，固定化酶可以用于酿造、发酵和食品加工过程中，提高生产效率和产品品质。
在医药领域，固定化酶可以用于药物合成和生物转化过程中，加快反应速率和提高产率。
固定化酶还可以用于环境保护、分析检测和能源转化等领域。
三、辅酶的再生技术1. 辅酶的重要性辅酶是许多酶催化反应中不可或缺的辅助因子，它能够促进酶的活性和催化效率。
然而，随着辅酶的消耗，酶的活性会逐渐降低，限制了反应的进行。
辅酶再生技术的研究成为了固定化酶领域的重要课题。
2. 辅酶再生技术的研究进展辅酶再生技术主要包括物理方法和化学方法。
常见的物理方法包括膜渗透技术和超声波辅助技术，通过对辅酶和酶的分离和再结合，实现辅酶的再生。
而化学方法则通过化学催化剂或化学反应将辅酶还原回可用形态。
这些方法在辅酶再生方面都取得了一定的研究进展，为固定化酶的应用提供了更多的可能性。
四、总结与展望固定化酶和辅酶再生技术在酶研究领域具有重要的应用前景。
通过固定化技术，可提高酶的稳定性和重复使用性，进一步推动酶的工业应用。
辅酶再生技术的发展也有助于提高酶催化反应的效率和产率。
未来，随着对酶机理和辅酶再生机制的深入研究，固定化酶和辅酶再生技术将得到进一步的完善和应用扩展，为更多领域的酶催化反应提供解决方案。
酶的固定化
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
酶的固定化
1）酶传感器的原理
酶传感器主要由固定 化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性 地“识别”并催化被 检测物质发生化学反 应 变换器：把催化反应 中底物或产物的变量 转换成电信号，通过 仪表显示出来。
65
（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层
感应电极
1967年Updike等采用 酶的固定化技术，将葡萄 糖氧化酶固定在疏水膜上， 然后再和氧电极结合，组 装成了世界上第一个生物 传感器——葡萄糖氧化酶 电极。
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
32
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3
4
5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
54
1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
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产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
固定化酶定义
固定化酶定义固定化酶固定化酶是指将天然酶或人工合成的酶固定在载体上，形成固定化酶催化剂的一种技术。
定义1.固定化酶：固定化酶是将酶与固体载体相结合形成的催化剂。
固定化酶具有较高的催化活性、稳定性和重复使用能力，可应用于多个领域。
2.载体：载体是指将酶固定在其上的固体材料。
常用的载体材料包括炭、纤维素、凝胶、金属氧化物等。
3.固定化技术：固定化技术是将酶与载体结合的过程，常见的固定化技术包括吸附、交联和共价结合等。
理由固定化酶相比于游离酶具有以下优势，使其在许多领域得到广泛应用：1.增强催化活性：固定化酶在催化反应中通常具有较高的催化活性，能够在相对温和的条件下实现高效催化。
2.提高稳定性：固定化酶能够耐受极端条件（如高温、酸碱环境等），具有更长的寿命和持久的催化效果。
3.可重复使用：固定化酶在催化反应后可以通过简单的分离和再生步骤进行回收和重复使用，降低了生产成本。
4.易于分离产物：固定化酶的载体通常具有良好的物理化学特性，可以实现催化产物的高效分离和纯化。
书籍简介《固定化酶：原理与应用》该书通过系统的介绍固定化酶的原理、固定化技术以及应用案例，深入探讨了固定化酶在各个领域的潜在应用价值。
内容包括：1.固定化酶的原理和分类；2.常见的固定化技术及其优缺点；3.固定化酶在生物医药、生物能源、环境保护等领域的应用；4.商业化生产中的固定化酶案例分析；5.未来固定化酶研究的发展趋势和挑战等。
本书内容深入浅出，既适合科研人员了解固定化酶的基本知识，也适合工程技术人员应用固定化酶技术解决实际问题。
无论是酶学研究新手还是经验丰富的专业人士，都能从中获得宝贵的参考和指导。
总结固定化酶是一种具有高催化活性、稳定性和重复使用能力的酶催化剂。
通过固定化技术，酶能够与载体结合从而实现其优势的应用。
固定化酶在各个领域具有广泛的应用前景，并且已经在医药、能源等领域取得了重要的成果。
《固定化酶：原理与应用》一书对固定化酶的原理、技术与应用进行了深入分析和讨论，是该领域学术研究者和工程技术人员的重要参考资料。
第五章酶的固定化
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
酶的固定化
3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1) 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2) 共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：(1 )天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；(2)有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等(3 )无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu 侧链的一COOH、C-末端的一COOH ; Tyr 的苯酚基；Cys 的一SH; Lys 的&NH2、N-末端一NH2；Thr、Ser 的一OH ; His 的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：(1 )重氮化法(2)叠氮法(3 )溴基化法(4)烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个一NH2,戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2〜7.2, 0C下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
酶固定化工艺优劣的评价
酶固定化工艺优劣的评价
酶固定化是一种将酶固定在载体材料上并形成酶固定化系统的工艺。
酶固定化工艺具有以下优势和劣势：
优势：
1. 提高酶的稳定性：酶固定化可以使酶更加稳定，不易受到环境因素的影响，如温度、pH值的变化等。
2. 增强酶的重复使用能力：酶固定化可以使酶在重复使用过程中更加稳定，延长其使用寿命。
3. 方便操作和分离：通过酶固定化，酶可以与载体材料牢固地结合，方便在反应后进行分离和回收，减少后续处理的复杂性。
4. 可控制的反应条件：通过酶固定化，可以更好地控制反应条件，提高反应的效率和产物的纯度。
5. 降低生产成本：酶固定化可以降低酶的使用量，减少酶的损失，从而降低生产成本。
6. 适用广泛：酶固定化可以适用于不同类型的酶和不同的反应系统。
劣势：
1. 固定化过程的复杂性：酶固定化的过程较为复杂，需要选择合适的载体材料、固定化方法和条件等。
2. 酶固定化后的活性损失：酶固定化可能会导致酶的活性损失，使得固定化酶的催化效率降低。
3. 物质传递限制：酶固定化后，底物和产物在固定化载体和酶之间的传递存在一定的限制，影响反应速率。
4. 载体材料的稳定性：一些载体材料可能在反应条件下发生分解或破坏，影响酶的稳定性和固定化效果。
5. 当前技术的限制：目前酶固定化技术仍然存在一些局限性，如固定化效果不稳定、固定化酶的寿命较短等。
总体来说，酶固定化工艺具有许多优势，但也存在一些劣势。
综合考虑，酶固定化工艺的应用还需要根据具体的实际情况来评估和选择。
生化技术固定化酶及微生物
●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数 酶经固定化以后， Vm 变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异 的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm 与游离酶相同； 但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只 相当于游离酶的1/10。
固定化酶稳定性提高的原因可能是： ➢带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间 构象起到稳定作用 ➢蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生 ➢固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机 溶剂等对酶的进攻破坏作用
（四）米氏常数
●米氏常数（K m ）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的K m 值，其倒数1/ K m 称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定 化酶的K m 值和最大反应速度（Vm ）常因酶蛋白结构的变化和载体带电 荷的影响而变化。
缺点：这种固定化酶制品只能应用于底物和产物的分子质量都小的反 应中
四、固定化微生物的制备
目前，固定化微生物的制备方法最多的是包埋法， 其次是载体结合法和交联法；另外，还有用选择性 热变法制备固定化微生物的，就是将细胞在适当温 度下进行处理，使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性 而使酶固定与细胞内的方法
此外，顺丁烯二酸酐或乙烯共聚物与酶分子在六 甲撑二氨作用下，相互间进行反应，亦可制成固定 化酶
3、包埋法
定义： 就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高 分子半透膜中制成固定化酶的方法
分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型
优点：由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变 化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应 用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚 乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单
第三节酶的固定化
第三节酶的固定化随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。
将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。
一、固定化酶的制备方法制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等（图2-3）。
1．包埋法将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
凝胶包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。
常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。
2．吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附法。
吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，而且可反复使用。
但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不太牢固而易脱落。
3．共价偶联法利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。
这种方法的优点是酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。
缺点是制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。
4．交联法交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之间发生交联作用而制成固定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
其中应用最广泛的是戊二醛。
用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。
第十三章 酶固定化
烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化， 然后与酶分子上的氨基、巯基、羟基发生烷基化反应， 制备固定化酶
共价结合法
特点：
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连
续使用。
缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而
影响酶的催化活性。
4、交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交 联反应，制备固定化酶的方法。 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等双功能试剂。 特点：
喷雾干燥 淀粉 淀粉酶 液化液 糖化酶 糖化液 结晶 异构酶 结晶葡萄糖 果糖42% 葡萄糖55% 低聚糖 高果糖浆 果糖浆 果糖80-90% 果糖55% 葡萄糖39% 低聚糖 氢化还原 粉状葡萄糖 山梨醇
果葡糖浆 混合
分离
天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 延胡索酸酶 β-半乳糖苷酶 天门冬氨酸-β-脱羧酶 脂肪酶
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
结合法 共价键结合法 离子键结合法 制备难易 难 易 包埋 法 吸附法 交联 法
较难
易
较难
结合程度
活力回收 再生 费用 底物专一性
强
低 不能 高 可变
中等
高 可能 低 不变
强
高 不能 低 不变
弱
高， 酶易流失 可能 低 不变
强
中等 不能 中等 可变
三、固定化酶的性质 1、酶的稳定性。
第十三章 酶固定化
第一节 酶的固定化
酶的固定化方法
固定化酶的性质 固定化酶的应用
为什么要将酶固定化？
游离酶在应用中的不足
稳定性较差； 难于回收重复利用；
给后续分离纯化增加困难。
酶的固定化
(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的 水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附 较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离 子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺 类（ECTEDLA）—纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)—纤维 素、DEAE—葡聚糖凝胶、Amberlite IRA—93、410、 900等。阳离子交换剂基，如羧甲基(CM)—纤维素、纤 维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、 Dowex—50等。
载体的选择
载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般 要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③载体必须含有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 ④载休没有或很少有非专一性吸附。 ⑤载体来源容易、便易、并能反复使用。
E.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y—氨基丙基三氧 乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:
烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍 生物:
此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合．产生固定化酶。
取代反应 具有卤素取代的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，在 碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应，如： 将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴 乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：
His
Lys
A. 多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-β-硫酸脂 乙砜基胺(ABSE—)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼 脂及淀粉) 载体。在碱性条件下用对-β-硫酸脂乙砜基胺活化多 糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：
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固定化植物细胞
1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
6
什么是固定化酶？
固定化酶（Immobilized Enzyme）：通过物理的 或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或 将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流 动，但能使酶充分定化酶
7
固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性；
（2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应
液发生化学反应；
（6）成本要低。
8
固定化酶的优点
长时间使用， 在绝大多数情 况下提高了酶 的稳定性，有 利用工艺的连 续化和管道化
1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚 苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定， 产生了固定化酶技术。
4
1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化酶技
术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定化 天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化酶 应用的局面。 1971年，第一次国际酶工程会议在美国召开，会议
13
一、影响固定化酶性质的因素
2、载体的影响
（1） 构象效应 （2） 空间屏蔽效应
14
（3） 微扰效应
（4）分配效应：载体 与底物带相同电荷-底 物少；反之则多。
15
（5）扩散限制效应 外扩散限制
内扩散限制
16
二、固定化后酶性质的变化
1、固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应 速度下降
26
5、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的
固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶
活力。 6、固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下， 固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的 连续工作的时间。
27
四、固定化酶的活力测定方法介绍
1、间歇测定：在搅拌或震荡反应中，在与溶液
酶相同测定条件下进行，然后间隔一段时间取
多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
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第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一、影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、评价固定化酶的指标
12
一、影响固定化酶性质的因素
1、酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
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3、pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象
（2）影响酶的催化基团的解离
（3）影响酶的结合基团的解离
（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或
结合后不能生成产物。
20
pH对固定化酶的影响：
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动;载体带正
1
2
极易将固定 化酶与底物、 产物分开
优点
酶的使用效 率提高，适 合于多酶反 应
9
酶反应过程可 以严格控制， 有利于工艺自 动化和微电脑 化
3
4
固定化酶的缺点
酶固定化时酶 的活力有所损 失. 增加了固定化的成 本，使工厂开始投 资大
只能用于可溶性的底 物和小分子底物，对 大分子底物不适宜
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固定化酶的优缺点：
电荷，pH向酸性方向移动。
21
3、pH的变化
2）产物性质对体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH 值比游离酶的pH值高；反之则低
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4、最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5、底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性往往会变化。
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特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效
率高、专一性强、作用条件温和等特点。
2
游离酶的缺陷：
大多数游离酶的稳定性比较差 ； 游离酶的使用成本较高； 一些游离酶存在自水解作用； 产物的分离提纯困难。
3
固定化酶的发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
主题是固定化酶的研制和应用,确定固定化酶
（Immobilized Enzyme）统一名称
5
1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 固定化细胞
1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功
1 Kat =1 mol/s = 60 mol/min = 60*106 umol/min = 6*106 IU 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA （DNA)所具有的酶活力单位
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三、评价固定化酶的指标：
3、
酶结合效率，又称为酶结合率，是指酶与载体结 合的百分率。
4、
酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定 化的总酶活力的百分率。
主要内容
第一节 概述
第二节 固定化酶的性质及其影响因素
第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
1
第一节 概述
什么是酶？
催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反 应速度，但不改变反应的平衡点。
样，过滤后按常规方法测定产物生成量或底物
的消耗量。
此法操作简单。
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四、固定化酶的活力测定方法介绍
原因：酶结构的变化
空间位阻
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二、固定化酶的性质
固定化对酶稳定性的影响
（1） 操作稳定性提高。
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。
(3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。
(4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高。
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2 、固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶 降低了酶的亲和力。
（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km‘ < Km
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三． 评价固定化酶的指标：
1、酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化 一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶
活单位。