体细胞杂交技术应用前景

植物体细胞杂交技术应用

摘要：植物有性杂交是遗传物质交换重组保持遗传多样性的主要途径，也是遗传育种的主要方法之一。然而，由于种质隔离的限制，植物不同种属间的遗传物质交流很难实现，从而限制了近缘种和野生种优良基因的利用。植物体细胞杂交技术使远缘杂交不亲和的植物有可能实现遗传物质重组，创造和培养植物新品种乃至新物种，尤其在多基因控制农艺性状的改良上具有较大优势。随着原生质体融合技术和现代分子生物学的发展，体细胞融合再生植株的植物种属范围不断扩大，杂种鉴定的方法和手段也有了很大提高。本文就近年来植物体细胞杂交的技术手段以及应用前景进行介绍，并展望了其应用和发展前景

关键词：体细胞杂交、前景

有性杂交是通过雌雄配子结合，实现双亲遗传物质转移和重组的常规育种手段。这一育种技术在植物育种工作中发挥了巨大的作用。但是远缘杂交的有性不亲和、双亲花期不遇、雌／雄不育等阻碍了这一技术在植物育种中的应用。植物体细胞杂交是以原生质体培养为基础，人工诱导使不同亲本原生质体融合，并通过对异核体的培养产生体细胞杂种的技术。它可以克服有性杂交遇到的前述障碍。体细胞杂交在转移抗逆性状，进行作物改良，实现远缘重组，创造新型物种，以及定向转移胞质基因控制的性状和利用配子一体细胞杂交产生三倍体植物上显示出重要的应用前景，并对丰富种质、保持和促进生物多样性具有重大的意义。利用体细胞杂交转移的基因为亲本自身所携带，不存在安全性问题。随着分子生物学的发展，在获得上述体细胞杂种的同时，体细胞杂交的技术、方法、检测手段等都得到了一定提高。

1.植物原生质体融合技术的发展

植物原生质体融合技术始于1970年，Power用硝酸钠为诱导剂进行较大规模的原生质体诱导融合。以这种阳离子诱导技术为基础，1972年，Carlson等报道获得第一株烟草体细胞杂交植株。1974年，Kao等借助动物细胞在聚乙二醇（PEG）诱导下实现细胞融合的技术，建立植物原生质体高频率诱导融合的PEG法，利用

PEG诱导原生质体融合，极大地促进了这一技术在多种植物中的研究，获得了大批融合产生的体细胞杂种。一些科间、属间的体细胞杂交相继展开。1978年，Melcher等获得马铃薯和番茄的第一个体细胞杂种。随后Zimmermann等发展了电融合法，使原生质体融合效率进一步提高。此后，PEG融合和电融合技术经过不断的改进和完善，使其成为今天体细胞杂交中广泛使用的技术。

随着原生质体培养技术逐渐的程序化和系统化，植物体细胞技术以日渐成熟。对体细胞杂交的亲本组合以开始有目的地进行选择，杂种细胞选择和杂种植株的鉴定方法也不断发展，配子-体细胞融合和配子细胞间的原生质体融合也开始发展。体细胞杂交作为一种育种的新途径，已经成为植物新种质创造的重要途径。

2. 体细胞融合的方法

诱导异源原生质体融合产生异核体(hetero—karyon)即杂种细胞，是体细胞杂交程序的第一个关键环节。目前主要有以下两种方法。

2．1 PEG—高ph高钙法

自20世纪70年代中期，Kao等[3 建立起聚乙二醇(PEG)——高pH 高钙法以来，直到20世纪90年代，所获得的体细胞杂种大部分是用该化学诱导法诱导融合产生的，后来又发展了电融合法和聚集微素激光法。但一直以来PEG法都被广泛使用，聚集微素激光法应用极少。1999年，夏光敏等[3 用PEG法诱导普通小麦与紫外线照射的高冰草原生质体融合，产生了具有优良性状的F 代穗系2001年Yue 等rl 用PEG法将獐毛麦的耐盐性转移到普通小麦。2005年Wang等采用PEG法将用IOA和紫外线分别用Arabidopsisthaliana(L．)Bupleurumscorzonerifolium w 川d．融合，形成科间不对称杂种并再生植株，染色体数目检测发现：紫外线照射的供体的染色体完整存在，但是受体染色体却被排斥，只有少数片段渗透到杂种细胞中。

2．2 电融合法

用细胞融合仪产生交变电压和高压脉冲电场诱导植物细胞融合，是目前研究最热的物理诱导融合法。1979年Senda 首次报道了植物原生质体可以在电脉冲作用下进行融合。Zirnmemenn等又进一步发展了动植物细胞电融合的方法和仪器。由于电融合较之化学融合有操作简便、易于控制、副作用小、融合率高、应用范围广

等特点。从20世纪80年代中期起，国外对动植物细胞电融合的方法和条件进行了大量研究，细胞杂交成功的例子相继被报道。随后植物原生质体电融合也相继成功并获得多种杂种愈伤组织。Sherraf等[3 用电融合法

诱导野生型番茄和耐盐系双单倍体土豆融合，得到再生植株，并得到介于双亲中间型的叶片和地下果实，杂种的耐盐性降低了50 。Brewer等[2 用电融合法诱导了植株矮小但可富积重金属锌和镉的Thlaspi caerulescens和植株较高大的Brassica na—pus融合，并得到在含高锌和镉的土壤中存活的再生植株，使通过体细胞杂交将高积累重金属品系的基因转移到其它植物中成为可能。他们同时对电融合参数进行了摸索，使电融合频率提高到13％。20世纪80年代末，我国也开始采用电激法进行体细胞杂交。郑强等对不同品种的白菜间进行了电融合试验；目前华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室通过电融合法对属间柑橘进行融合，得到多种属间体细胞杂种。20世纪90年代国内外还同时开展了空间电融合技术的研究[1 ，发现微重力环境可以改善细胞电融合技术，使电融合频率升高到18．8 ，异核细胞的成活率也高于50 。电融合操作方便，又避免了化学方法对原生质体带来的毒害，融合频率也大大提高，因而得到普遍应用。但原生质体融合的频率直接受电压大小、场强、脉冲强度和幅宽以及脉冲次数的影响，对于不同的植物材料，需要经过实验来找出这些参数的适当值。

3 体细胞融合体系的类型

体细胞杂种按照融合产物的细胞核组分来看，可以分为对称性和非对称性细胞杂种两类，非对称细胞杂种又分为核不对称和胞质杂种两类。一般来说，对称融合多形成对称杂种，其结果是在导入有用基因(或优良性状)的同时，也带入了亲本的全部不利基因(或性状)；而对称融合只转移部分核基因或者只转移胞质内容物，从融合再生植株中挑选具有优良性状的植株，从而缩短育种时间；此外还可采用配子与体细胞杂交来产生三倍体植物。在原生质体技术发展初期，人们试图通过原生质体融合(对称体细胞融合)将两个亲缘关系较远的物种基因组结合在一起，创造新的植物类型。然而融合产物虽得到再生植株，但其可育性及形态特征趋于不正常化，且双亲染色体出现不可控性排斥与丢失，或者获得的体细胞杂种愈伤组织难以分化。而携带受体全部染色体和供体少数染色体或染色体片断的不对称