细胞基因组DNA的提取.ppt
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对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断， 但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。
? 核酸酶的抑制和抑制剂
DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
? 核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质
1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
? 核酸提取的一般过程
3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污
染,并除去提取过程中的系列试剂 (盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是 温度和介质
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
保存介质 ： TE缓冲溶液 (最常用 ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
实验目的
材料与试剂
实验操作与注意事项
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
? 核酸制备中常用的酶
DNase RNase 蛋白酶 K 溶菌酶
? 核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
原 因
1. DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有
酒精残留，酒精抑 对
制后续酶解反应
策
3. DNA中残留有金属 离子
1. 重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2. 重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
五、DNA提取常见问题
?问题二： DNA 降解
一、实验原理
3、核酸制备的一般原则
? 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
? 核酸制备的步骤：
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
? 核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
一、实验原理
4、核酸制备的一般方法和原理
? 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶
活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当 然，几个条件并用更好。
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 张力拉断则更重要。
? 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
? 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
? 植物材料－－液氮研磨 ? 动物组织－－匀浆或液氮研磨 ? 组培细胞－－蛋白酶K ? 细菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠
? 高温温浴时，定时轻柔振荡
四、注意事项 ——核酸分离、纯化
? 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
? 核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的 RNase抑制剂。
? 核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对 RNase 、DNase 有一定的抑制作用。
细胞基因组DNA的提取
银巍 中山医学院生化教研室
实验一 细胞基因组 DNA的提取
一、实验原理
1、核酸的分类
? DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
? RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
? 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔
? 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
? 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
Leabharlann Baidu
四、注意事项 ——核酸沉淀、溶解
? 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
? 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利 于充分沉淀
,1000rpm,5min离心
四、注意事项 ——材料准备
? 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
? 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
? 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
? 含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
四、注意事项 ——细胞裂解
? 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 ? 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ? 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
? TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase ? pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
五、DNA提取常见问题
?问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应。
? 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一、实验原理
2、核酸制备的一般原则
? 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。
? 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
? 核酸酶的抑制和抑制剂
DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
? 核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质
1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
? 核酸提取的一般过程
3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污
染,并除去提取过程中的系列试剂 (盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是 温度和介质
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
保存介质 ： TE缓冲溶液 (最常用 ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
实验目的
材料与试剂
实验操作与注意事项
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
? 核酸制备中常用的酶
DNase RNase 蛋白酶 K 溶菌酶
? 核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
原 因
1. DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
2. DNA在溶解前，有
酒精残留，酒精抑 对
制后续酶解反应
策
3. DNA中残留有金属 离子
1. 重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2. 重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
3. 增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
五、DNA提取常见问题
?问题二： DNA 降解
一、实验原理
3、核酸制备的一般原则
? 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
? 核酸制备的步骤：
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
? 核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
一、实验原理
4、核酸制备的一般方法和原理
? 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶
活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当 然，几个条件并用更好。
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 张力拉断则更重要。
? 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
? 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
? 植物材料－－液氮研磨 ? 动物组织－－匀浆或液氮研磨 ? 组培细胞－－蛋白酶K ? 细菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠
? 高温温浴时，定时轻柔振荡
四、注意事项 ——核酸分离、纯化
? 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
? 核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的 RNase抑制剂。
? 核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对 RNase 、DNase 有一定的抑制作用。
细胞基因组DNA的提取
银巍 中山医学院生化教研室
实验一 细胞基因组 DNA的提取
一、实验原理
1、核酸的分类
? DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
? RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
? 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔
? 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
? 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
Leabharlann Baidu
四、注意事项 ——核酸沉淀、溶解
? 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分
? 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利 于充分沉淀
,1000rpm,5min离心
四、注意事项 ——材料准备
? 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
? 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
? 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
? 含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
四、注意事项 ——细胞裂解
? 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 ? 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ? 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
? TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase ? pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
五、DNA提取常见问题
?问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应。
? 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一、实验原理
2、核酸制备的一般原则
? 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。
? 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。