PCR引物设计原则.ppt
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发夹结构
–尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的 几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能 进行任何修饰，否则不能进行有效的延 伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到 密码子的简并性，引物3’端最后一个碱 基最好不与密码子第三个碱基配对。
– 引物浓度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328
＋T×303-61）/VH2O
VH2O (单位：L)
退火温度
– 最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25
– 一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目的DNA结合， PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR结果密切相关。
–扩增区域的自由能（△G。）小于 58.61kJ/mol
–引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃ Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) 500/lengt
引物与PCR
引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L
引物设计
引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物与PCR 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
ห้องสมุดไป่ตู้物（primers)
引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
引物设计软件
Primer Premier 5.0
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
如何使用Primer Premier 5.0
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
碱基分布的均衡性
引物设计
–一般引物设计 –5’带酶切位点引物设计 –巢式PCR引物设计 –多重PCR引物设计
探针设计
引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
–尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作 为引物
–选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引 物
–选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源 的序列作为引物
–对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参 数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
–尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 碱基互补
同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性
– GC含量太高也易于引发非特异扩增。
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
–对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
– 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
引物的保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽可能多的型别
特异性：避免非特异性扩增
扩增区域的二级结构
模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构， 在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些 区域。
引物5’端
引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
–5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
–5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。
–5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。
引物的内部稳定性
过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。
现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
– 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。
–尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的 几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能 进行任何修饰，否则不能进行有效的延 伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到 密码子的简并性，引物3’端最后一个碱 基最好不与密码子第三个碱基配对。
– 引物浓度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328
＋T×303-61）/VH2O
VH2O (单位：L)
退火温度
– 最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25
– 一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。
→ Sense primer
3’
5’
5’
← 3’
Antisense primer
引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA 特异结合，不与其他非目的DNA结合， PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物 进行有效的延伸，可见引物设计好坏与 PCR结果密切相关。
–扩增区域的自由能（△G。）小于 58.61kJ/mol
–引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃ Tm product = 81.5 + 16.6 log ([K+]/(1+0.7[K+])) + 0.41 (%G + %C) 500/lengt
引物与PCR
引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L
引物设计
引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物与PCR 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析
ห้องสมุดไป่ตู้物（primers)
引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
引物设计软件
Primer Premier 5.0
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
如何使用Primer Premier 5.0
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
碱基分布的均衡性
引物设计
–一般引物设计 –5’带酶切位点引物设计 –巢式PCR引物设计 –多重PCR引物设计
探针设计
引物评析
引物同源性分析
用Blastn软件进行同源性比较
–尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作 为引物
–选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引 物
–选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源 的序列作为引物
–对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参 数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
–尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 碱基互补
同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性
– GC含量太高也易于引发非特异扩增。
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
–对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
– 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
引物的保守性与特异性
保守性：通用引物——检测同一类病原 微生物尽可能多的型别
特异性：避免非特异性扩增
扩增区域的二级结构
模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构， 在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些 区域。
引物5’端
引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
–5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
–5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。
–5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。
引物的内部稳定性
过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。
现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
– 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。