几种MIC的测定方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（用酶标仪测得OD600）。当阳性对照孔（即不含抗菌肽）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。
1.1.3. 培养基 推荐使用LB肉汤培养基，pH7.0~7.4。指示菌为大肠杆菌或沙门氏菌。
1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的LB肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或LB肉汤培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用LB肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃摇床培养16~20h。
1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或者用分光光度计测定OD600，与未接菌的比对，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlLB肉汤外，其余每管加入LB肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1024μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。（注：在稀释的过程中，每次吸取1ml到下一管中后，要换掉枪头，后面的方法相同）
2.1.1培养基和抗菌肽原液制备 使用LB琼脂，pH7.2~7.4。按照倍比稀释法，分别配制12800、6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5ug/mL的抗菌肽原液（如采用90%的抗菌肽，可以从3200ug/mL进行稀释）。
2.1.2含抗菌肽琼脂平板制备 将配制好的LB液体培养基放入12个50mL三角瓶中，每个小三角瓶20ml液体培养基，每个三角瓶加入0.2g琼脂粉，纱布封口后高压灭菌。灭菌后，冷却至并在50~55℃（或至于该温度水浴中），每个三角瓶培养基中加入200uL的抗菌肽原液，并设置一个对照（不加入抗菌肽原液），则三角瓶中的培养基抗菌肽浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0ug/mL。充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
2.2 琼脂打孔法：
2.2.1 如前面所示，配制256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml的抗菌肽溶液。
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl，密封后置37℃摇床孵育16~20h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
1.2.微量肉汤稀释法 （酶标板）
1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。
1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。 第12孔不加药作为生长对照，如果当时不使用，则冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的方法
1浊度法
1.1常量肉汤稀释法（试管）
1.1.1.抗菌药物贮存液制备
将抗菌肽稀释到无菌水中，制成1024μg/ml的原液，（也可以用0.22um滤膜进行过滤，但要去掉前面5ml的过滤抗菌肽溶Leabharlann Baidu）。抗菌药物贮存液浓度按照不同梯度稀释。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
2.1.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以微量取液器将制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU/mL，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置37℃孵育16~20h，观察结果。
2.1.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
2.琼脂稀释法
2.1 琼脂稀释法：
琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌肽药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH或LB琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.1.3. 培养基 推荐使用LB肉汤培养基，pH7.0~7.4。指示菌为大肠杆菌或沙门氏菌。
1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的LB肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或LB肉汤培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用LB肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃摇床培养16~20h。
1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或者用分光光度计测定OD600，与未接菌的比对，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlLB肉汤外，其余每管加入LB肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1024μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。（注：在稀释的过程中，每次吸取1ml到下一管中后，要换掉枪头，后面的方法相同）
2.1.1培养基和抗菌肽原液制备 使用LB琼脂，pH7.2~7.4。按照倍比稀释法，分别配制12800、6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5ug/mL的抗菌肽原液（如采用90%的抗菌肽，可以从3200ug/mL进行稀释）。
2.1.2含抗菌肽琼脂平板制备 将配制好的LB液体培养基放入12个50mL三角瓶中，每个小三角瓶20ml液体培养基，每个三角瓶加入0.2g琼脂粉，纱布封口后高压灭菌。灭菌后，冷却至并在50~55℃（或至于该温度水浴中），每个三角瓶培养基中加入200uL的抗菌肽原液，并设置一个对照（不加入抗菌肽原液），则三角瓶中的培养基抗菌肽浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0ug/mL。充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
2.2 琼脂打孔法：
2.2.1 如前面所示，配制256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml的抗菌肽溶液。
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加90μl，密封后置37℃摇床孵育16~20h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
1.2.微量肉汤稀释法 （酶标板）
1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。
1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml。 第12孔不加药作为生长对照，如果当时不使用，则冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的方法
1浊度法
1.1常量肉汤稀释法（试管）
1.1.1.抗菌药物贮存液制备
将抗菌肽稀释到无菌水中，制成1024μg/ml的原液，（也可以用0.22um滤膜进行过滤，但要去掉前面5ml的过滤抗菌肽溶Leabharlann Baidu）。抗菌药物贮存液浓度按照不同梯度稀释。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
2.1.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以微量取液器将制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU/mL，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置37℃孵育16~20h，观察结果。
2.1.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
2.琼脂稀释法
2.1 琼脂稀释法：
琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌肽药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH或LB琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。