试验酶活测定方法
酶活测定方法
酶活测定方法
测酶活？这事儿超简单！先准备好各种试剂，就像准备一场美食盛宴的食材。
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酶活性测定实验室标准操作规程
酶活性测定实验室标准操作规程
1. 引言
本标准操作规程旨在确保酶活性测定实验室操作的准确性和一
致性。
该实验室用于测定酶的活性，以评估其催化反应速率，为进
一步研究和应用提供依据。
2. 实验室准备
- 确保实验室环境清洁整洁，排除干扰因素。
- 准备所需试剂、仪器和设备，并进行校准和验证。
3. 样品准备
- 按照实验要求准备待测酶样品。
- 保持样品的完整性和稳定性，避免污染和损伤。
4. 实验步骤
4.1 样品稀释
- 使用适当的缓冲液稀释待测酶样品，以达到合适的测试范围。
4.2 酶活性测定
- 将稀释后的样品与适当的底物混合，并按照预定的反应时间进行反应。
- 使用光谱仪、荧光仪或其他相关仪器测定反应产物的生成情况。
4.3 数据处理
- 记录实验过程中所有操作的详细信息。
- 根据实验结果计算酶的活性，并进行数据统计和分析。
5. 质量控制
- 定期进行实验室内部质量控制，包括使用质检样品进行标准曲线校准和验证。
- 确保实验操作符合质量管理体系要求。
6. 安全注意事项
- 遵守实验室的安全规定，包括佩戴适当的个人防护装备。
- 确保试剂的正确使用和储存，避免有害物质的暴露和泄漏。
7. 结论
本标准操作规程为酶活性测定实验室提供了一套明确的操作指南，用于确保实验操作的准确性和一致性。
遵循该规程可提高实验结果的可靠性，并为进一步研究和应用提供有力支持。
探究酶活性的实验设计
探究酶活性的实验设计酶活性是指酶在一定条件下催化反应的能力，影响酶活性的因素有很多，如温度、pH值、底物浓度等。
本文将探究酶活性的实验设计，通过实验方法和步骤的讲解，展示如何准确、科学地研究酶活性。
一、实验目的探究不同条件下酶活性的变化规律，分析影响酶活性的因素。
二、实验材料和设备1. 反应物料：酶溶液、底物溶液2. 实验器材：试管、移液管、计时器、恒温水浴、pH计、离心机等三、实验步骤1. 准备工作：a. 将酶溶液和底物溶液置于恒温水浴中，使其温度稳定在实验需要的温度（如37°C）。
b. 准备一系列不同pH值的缓冲液，确保在实验中能控制pH值。
c. 测量底物的浓度，并调整为实验所需的浓度。
2. 温度对酶活性的影响实验设计：a. 取若干试管，并标记好温度，如20°C、30°C、40°C等。
b. 向每个试管中加入相等体积的酶溶液和底物溶液。
c. 将试管放入恒温水浴中，分别加热或冷却到所标注的温度并保持一段时间。
d. 在预定时间间隔内，取出试管，通过添加某种试剂停止反应，并用比色法或浊度计等设备测定产物的生成量。
3. pH值对酶活性的影响实验设计：a. 取若干试管，并加入等体积的酶溶液和底物溶液。
b. 分别向每个试管中加入不同pH值的缓冲液，如pH=5、pH=7、pH=9等。
c. 将试管放置于恒温水浴中，保持一定时间。
d. 在适当时间内，用某种试剂停止反应，并通过测定反应产物的生成量来研究酶活性的变化。
4. 底物浓度对酶活性的影响实验设计：a. 在试管中加入等体积的酶溶液，且底物浓度分别设为1mol/L、0.5mol/L、0.2mol/L等。
b. 将试管放于恒温水浴中，反应一定时间。
c. 使用某种试剂停止反应，并测定生成的产物浓度。
d. 通过产物浓度的变化，探究底物浓度对酶活性的影响。
四、数据处理和分析1. 温度对酶活性的影响：a. 绘制反应速率随温度变化的曲线图，分析酶活性与温度的关系。
酶活光谱测定方法
酶活光谱测定方法如下：
一种常见的酶活光谱测定方法是通过测量酶催化底物的吸收或产物的发射来确定酶的活性。
具体步骤如下：
1. 准备适当的试剂和底物：根据需要选择合适的试剂和底物，以便与目标酶发生反应并产生可测量的光信号。
2. 设置实验条件：根据具体的酶反应要求，设置合适的温度、pH值和其他必要的条件。
3. 添加酶和底物：将适量的酶和底物加入到测定系统中。
4. 开始测定：在适当的波长范围内进行光谱测定。
对于吸收光谱测定，使用分光光度计或其他吸光度测定仪器记录酶催化反应过程中的吸光度变化；对于发射光谱测定，使用荧光光谱仪或其他相关设备来测量产生的荧光信号。
5. 分析数据：根据光谱数据，通过计算测定值与对照组的差异或其他方法来确定酶活性的水平。
酶活测定实验方案
在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。
植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
三种主要酶活测定方法
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
测定酶活性的方法
测定酶活性的方法
测定酶活性的常用方法有以下几种：
1. 吸光测定法：利用酶催化底物反应产生的产物对特定波长的光的吸收变化进行测定，常见的方法有比色法和荧光法。
2. 浊度测定法：在酶催化底物反应中，产生的沉淀、胶束或团聚物等形成浑浊或沉淀，通过测定反应溶液的浊度变化来确定酶活性。
3. 冷凝法：利用酶催化底物反应产生的产物，通过与特定试剂发生反应产生气体或形成沉淀，在特定条件下进行冷凝，并通过测定冷凝物的质量或体积变化来确定酶活性。
4. 离子选择性电极法：利用通过酶催化底物反应产生或消耗的离子浓度变化，通过检测特定离子选择性电极反应电位的变化来测定酶活性。
5. 标记物测定法：将底物或产物标记上特定的分子或放射性核素，通过测定标记物在反应中的变化来测定酶活性，如放射性测定法、荧光标记物测定法等。
这些方法根据不同的实验要求和酶的特性可以选择不同的测定方法来进行酶活性的测定。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
酶活测定方法(翻译)
测定方法（FIP法脂肪酶，pH 7）步骤：分析“真菌脂肪酶国际f.i.p.标准”通过自动滴定：在反应容器中添加底物乳液24毫升，蒸馏水9毫升，2毫升的牛磺胆酸钠溶液。
在37℃±0.5℃预培养反应容器10±15分钟。
将pH电极和滴定管的前端浸入到该溶液中。
将氮气轻轻的吹到溶液中（可选）。
用0.02 N NaOH将pH值调整至7。
设置自动滴定管至零。
添加精确的5毫升的酶溶液；同时开始计时。
用自动滴定法维持pH值在7。
10分钟后，立即“手动”加入滴定剂（0.02n NaOH）把pH值提升至9。
这必须在30秒内完成。
读出滴定管体积并记录0.02N的NaOH消耗的体积（N1）。
用相同的方法再做一次空白对照组，但是要将另外加入酶的时间延迟在滴定的PH值为9的时候。
由于酶降低pH值，当pH 值再返回为9时，进一步添加氢氧化钠0.02N。
读取并记录0.02n NaOH消耗量（N2）。
通过手动滴定：该程序是相同的自动滴定法，用手动滴定从0.02 n ，25毫升的氢氧化钠滴定管,滴下0.02毫升，使pH值保持在7.0。
计算:一个单位的酶活性（FIP单元）是指数量的一个标准（真菌脂肪酶脂肪酶制剂国际f.i.p.标准），根据所描述的测定条件，每分钟从橄榄油中释放1µmol的脂肪酸。
比活性被表示为国际FIP 单位每毫克酶制剂。
用公式计算酶制剂的活性1ml 0.02N的NaOH对应于中和20µmol的脂肪酸。
5ml酶溶液每间隔10分钟的时间释放（N1-N2）20毫升×µ摩尔脂肪酸。
如果酶液中含有C毫克的酶制剂/毫升，具体的活性计算如下：其中（N1 - N 2）体积（毫升）的NaOH是用于滴定。
使用已知活性的酶参考标准，它是由“中心委员会标准”控制的，消除了由于在试剂（如阿拉伯树胶，橄榄油，衬底乳剂）的质量，实验室间的差异或在实验设置上存在的差异。
酶活性使用参考标准（FIP单位/毫克）由下式计算其中A是单位/毫克的测试样品（测量）；B是真菌脂肪酶国际f.i.p. /毫克单位标准（测量）;C 是真菌脂肪酶f.i.p. FIP国际标准单位/ mg（瓶子上的说明）。
酶比活力测定实验报告
酶比活力测定实验报告酶比活力测定实验报告引言：酶是一类催化生化反应的生物催化剂，对于维持生命活动和调节新陈代谢过程起着至关重要的作用。
酶的活力是衡量酶催化能力的重要指标，而酶比活力则是不同酶之间活力的比较。
本实验旨在通过比较不同酶的活力，探究酶的催化效率及其在生物体内的重要性。
实验材料与方法：实验材料：酶提取液、底物溶液、缓冲液、酶活性显色剂。
实验方法：1. 酶提取：将待测酶提取液与缓冲液按一定比例混合，加入适量冷冻碎冰，离心沉淀。
2. 酶比活力测定：取不同酶提取液，加入相应底物溶液，反应一定时间后，停止反应并加入酶活性显色剂。
3. 光密度测定：使用分光光度计测定各样品的光密度，得到反应的速率。
实验结果与讨论：通过实验我们得到了不同酶的比活力数据，并进行了数据处理和分析。
首先，我们发现不同酶的比活力存在明显差异。
以酶A为例，其比活力为X单位，而酶B的比活力为Y单位。
这说明酶A在单位时间内催化反应的能力要高于酶B，即酶A具有更高的催化效率。
这可能是由于酶A在结构上与酶B存在差异，导致其催化底物的能力更强。
其次，我们还观察到酶的比活力与温度的关系。
在实验中，我们将酶A在不同温度下进行了测定，得到了不同温度下的比活力数据。
结果显示，随着温度的升高，酶A的比活力呈现出逐渐增加的趋势。
这是因为在较低温度下，酶分子的运动较为迟缓，催化反应的速率较慢；而在较高温度下，酶分子的运动加快，催化反应的速率也相应增加。
然而，当温度过高时，酶分子的结构可能发生变性，导致酶的活性降低甚至丧失。
此外，我们还探究了酶的比活力与底物浓度的关系。
实验中，我们分别取不同浓度的底物溶液，测定了酶A的比活力。
结果显示，随着底物浓度的增加，酶A的比活力也呈现出逐渐增加的趋势。
这是因为在较低底物浓度下，酶与底物的碰撞机会较少，催化反应的速率较慢；而在较高底物浓度下，酶与底物的碰撞机会增加，催化反应的速率也相应增加。
结论：通过本次实验，我们得出了以下结论：1. 不同酶的比活力存在明显差异，表明酶的催化效率不同。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
酶活测定方法
1.药剂的配置1.1DNS配置：182g酒石酸钾钠，溶于500ml蒸馏水中，40-50℃水浴加热，依次放入6.3gDNS，21g NaOH，5g重蒸酚，5g亚硫酸钠，搅拌溶解后定容1L，放置7d后使用。
1.2pH4.5 丙二酸钠-丙二酸缓冲液（100mmol/L）1.6604g丙二酸钠，1.0406g丙二酸各放入100ml蒸馏水中，混合比例约等于1：1，酸要少倒一些。
1.3pH3.0酒石酸钠-酒石酸缓冲液（100mmol/L）1.9405g酒石酸钠，1.5009g酒石酸各放入100ml蒸馏水中，混合比例为5：11。
1.4pH4.6 乙酸钠-乙酸缓冲液（100mmol/L）0.6ml冰醋酸，0.82g乙酸钠各放入100ml蒸馏水中，混合比例为4：61.5pH6.5 磷酸缓冲溶液（50mM）1.3609g磷酸二氢钾（酸性），2.2822g磷酸氢二钾（碱性）各放入200ml蒸馏水中，混合比例为1.71：11.6ABTS（20mM）1.09736g于100ml水中1.7MnSO4（10mM）0.169g于100ml水中1.8H2O2（20mM）45.35ul（30%）于20ml水中1.9V A（40mM）0.6725g于100ml水中1.10邻苯二酚（50mM）0.551g于100ml水中1.111%CMC，1%可溶性淀粉均用pH4.6的醋酸钠缓冲溶液稀释2．测定方法2.1漆酶2ml体系pH4.5丙二酸钠缓冲液（100mM）1.7ml，粗酶液200ul，ABTS（20mM）100ul，OD420测定1min内的吸光度变化。
酶活单位：每分钟氧化1μmol底物（ABTS）所需要的酶量为一个酶活单位（U）计算公式：2.2多酚氧化酶pH6.0磷酸缓冲液（50mM）4ml，邻苯二酚（50mM）1ml，粗酶液100ul，30℃，30min，测OD410吸光度值，以灭活菌液为对照。
酶活单位：每分钟使OD410改变0.01为一个酶活单位计算公式：以每克样每分钟内A410增加0.01为1个酶活力单U。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活的测定方法
酶活测试及试剂1 木素过氧化物酶（Lip）：3ml反应体系：①0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0) 1.5mL；②10mmol/L藜芦醇1.0mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，25℃反应3min。
于310nm测其光密度，以1.0mL缓冲液代替藜芦醇作空白对照，定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。
0.1mol/L酒石酸缓冲液(pH3.0)：配0.1mol/L的酒石酸和酒石酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为3.0。
（酒石酸：分子量75，0.1mol/L溶液为7.5g/L。
酒石酸钠：分子量230，0.1mol/L溶液为23g/L）10mmol/L藜芦醇：1.682g藜芦醇添加到1L水中即可（试剂藜芦（3,4-Dimethoxybenzyl alcohol）的分子量为168.19）10mmol/L H202（按1L计算）：称取1.13g过氧化氢试剂加入到1L纯水中即可（原试剂含30% H202）2 锰过氧化物酶（MnP）：3ml反应体系：① 0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5) 2.0mL；②15mmol/LMnSO4 0.5mL；③粗酶液0.4mL；④10mmol/L H202 0.1mL启动反应，37℃反应3min。
240nm测吸光值变化。
三价锰离子的吸光系数为8100 M−1 cm−1）0.05mol/L琥珀酸缓冲液（丁二酸）(pH4.5)：配0.05mol/L的琥珀酸和琥珀酸钠溶液各100mL，然后分别取出部分混合均匀至pH值为4.5。
（琥珀酸：分子量118.09，0.05mol/L 溶液为5.9g/L。
琥珀酸钠：分子量270.15，0.05mol/L溶液为13.5g/L）15mmol/L MnSO4（按1L计算）：2.535g硫酸锰加入到1L纯水中溶解即可。
酶活DNS法测定
酶活DNS法测定一、将初筛的菌株接入100mL 种子培养基(250ml 三角瓶) 中, 25 ℃150r ·min - 1 培养24h（此步骤在初筛期省略）,取培养至对数生长期的种子液3mL 接入60mL 发酵培养基(250mL规格三角瓶)中发酵培养。
在30℃,150r ·min - 1 转速下培养144h ,8000r ·min - 14 ℃离心10min ,取上清用DNS 法测酶活。
二、标准曲线的制作精确称取100 ℃干燥至恒重的葡萄糖0. 10g ,加蒸馏水溶解并定容至100mL ,配成1.00mg ·mL - 1浓度的溶液,（按表1）在各比色管中加入溶液,沸水浴反应5min ,冷却加蒸馏水定容至25mL 后,以去离子水作为空白校正,用紫外分光光度计于550nm下测A值。
三、褐藻酸酶活力测定- DNS 法3 ,5-二硝基水杨酸法测定酶活力 ,利用比色法测定酶解后还原产物的生成量 ,以表示酶的活力。
具体为:吸取 1 mL 发酵液 ,2 mL 1 %褐藻酸钠溶液(pH7. 0 的 1/ 15N 的磷酸缓冲液配制) ,于试管中混匀 ,并且以 1 mL 蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。
置于40 摄氏度水浴糖化30 min ,取出后立即于沸水中煮沸 15 min 使酶失活。
冷却 ,过滤 ,吸取 1 mL 滤液于比色管中 ,加入 3 ,5-二硝基水杨酸显色剂3 mL,再沸水浴 15 min ,冷却 ,用蒸馏水定容至 25 mL ，混匀 ,在 550 nm 下测光密度(用蒸馏水调零) 。
酶活力单位定义为 ,在实验条件下 ,每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成 1μg还原糖所需的量。
4、菌株的产酶曲线的测定在复筛培养基中接入2mL 对数生长期的菌株一组,从48小时起，每隔18--24h测量发酵液的酶活力,并且测量发酵液于550nm下的A值,从而做出产酶曲线，得到最大酶活时间并为以后的测定提供参考时间。
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1淀粉酶活性测定
原理
淀粉酶从淀粉中分解出还原物质，可以从他们与3，5—二硝基水杨酸的还原反应能力来测定这些还原物质，以一水麦芽糖计算。
一个淀粉酶单位相当于在规定条件下释放lmg还原碳水化合物(以一水麦芽糖计算)时所需的酶量。
主要试剂
(1)磷酸盐缓冲液(PH 6.9)；取0.067M的磷酸二氢钾溶液(9.12gKH2PO4溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)与0.067M的二水磷酸氢二钠溶液 (11.93gNa2HPO4·2H20溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)混合，直至用测得其PH值达到6.9为止。
取39mg氯化钠溶于35ml上述溶液内，并用蒸馏水定容至lOOml。
(2)底物溶液：取1.Og可溶性淀粉溶于lOOml上述磷酸盐缓冲液。
(3)指示剂溶液：取1.Og 3,5-二硝基水杨酸(C7H4N207)与少许蒸馏水拌和。
添加20ml2N氢氧化钠溶液后此酸便溶解。
取30.0g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)溶于此溶液，并用蒸馏水将此指示剂定容至100ml。
(4)麦芽糖溶液；称取lOOmg一水麦芽糖(C12H22O11·H20)用蒸馏水定容至lOOml。
测定方法
用移液管将1.Oml底物溶液移入一试管，并加热至25℃。
加1.Oml酶溶液(同样也已预热至25℃)，摇匀，保温3min后加2ml指示剂溶液，终止反应。
将此溶液置于沸水浴中5min后，取出来置于冰水中或进行流水冷却。
随后用蒸馏水定容至20ml。
用分光光度计于490nm处，以空白值为参比测定其颜色深度。
以1ml灭活的酶液作为空白对照。
2脂肪酶活性测定
原理
脂肪酶为一种水解酶，在一定条件下，可以把甘油三酯脂肪逐步水解，最后生成甘油及对应的脂肪酸。
用己知浓度的标准溶液对水解液进行滴定，即可定量求出脂肪酸的量，从而求出脂肪酶活性。
1个脂肪酶单位相当于在试验条件下释放出1μmol醋酸所需的量。
主要试剂
(1)0.025 mol·L-1磷酸缓冲液(PH 7.5)：
<l>甲液：称取KH2PO417．Olg，加水定容到500ml。
<2>乙液：称取Na2HPO4·12H2O 44.7g，加水定容到500ml。
<3>取甲液13ml，乙液lOOml混合，即成PH 7.5、0.25 mol·L-1磷酸缓冲液，再稀释10倍即成PH 7.5、0.025 mol·L-1磷酸缓冲液。
(2)聚乙烯醇橄榄油乳化液：
<l>4％聚乙烯醇液：称取40g聚乙烯醇(聚合度为1000～1750)，加蒸馏水约1000ml，水浴加热搅拌至溶。
冷却后定容至1000ml，双层纱布过滤，备用。
<2>最终乳化液：取上述4％聚乙烯醇溶液150ml，加50ml橄榄油，于高速组织捣碎机中搅动6分钟(分两次进行)，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。
(3)0.05 mol·L-1氢氧化钠标准溶液：称取40g氢氧化钠加蒸馏水至1000ml，成为约1N的溶液，经标定浓度后准确稀释到0．05N。
(4)1％酚酞指示剂：lg酚酞溶于100m195％乙醇中。
测定方法
加5ml 0．025 mol·L-1(PH 7．5)磷酸缓冲液和4ml聚乙烯醇橄榄油乳化液于三角烧瓶中，置于40℃水浴中预热lOmin。
加入酶液lml，40℃保温15min，立即加入15ml 95％的乙醇终止酶的反应。
加酚酞指示剂2—3滴后以0.05 mol·L-1氢氧化钠标准溶液滴定到微红色，记下氢氧化钠溶液的消耗体积。
重复二次测定。
并以lml灭活酶液代替作为空白对照。
3蛋白酶活性测定
原理
磷钨酸和磷钼酸的混合物(即福林酚试剂)在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钼蓝和钨蓝混合物)。
用蛋白酶催化水解血红蛋白(底物)游离出含酚基的氨基酸，与福林酚试剂呈蓝色反应，可从蓝色的深浅测定酶活性的大小。
在37℃,每分钟胃蛋白酶A分解血红蛋白产生的溶于三氯乙酸的物质，与福林酚试剂反应后在660nm的光吸收值相当于lμg分子酪氨酸所给出的光吸收值则为1个单位。
主要试剂
(1)底物溶液(2％血红蛋白)：lg血红蛋白溶于50ml 0.06N盐酸。
(2)1N福林酚试剂。
(3)0.5N氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4g，用蒸馏水定容至200ml。
(4)5％三氯乙酸： 5g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水。
(5)0.0lN盐酸：取盐酸0.84 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。
(6)0.06N盐酸：取盐酸5.04 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。
(7)0．2N盐酸：取盐酸16.8 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。
(8)酪氨酸标准液：精密称耿干燥到恒重的酪氨酸0.01812 g，用0，2N盐酸溶解并稀释到100ml，此溶液每ml含酪氨酸1μg分子。
测定方法
在25℃恒温条件下，取3支试管按表8进行测定。
表8蛋白酶活性测定。