使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
一种快捷有效的构建cDNA文库的方法
一种快捷有效的构建cDNA文库的方法徐远峰;黄文峰;高艳梅;翟金玲;黄惜【期刊名称】《贵州科学》【年(卷),期】2009(027)003【摘要】构建cDNA文库是研究基因组功能基因一种有效的手段,传统的建库方法通常需要在双链cDNA两端分别加上带限制性酶切住点的接头序列,通过酶切使之产生与质粒匹配的粘性未端,然后与质粒连接构成文库.本文介绍一种简单而且不需要核酸内切酶的构建cDNA文库的方法.该方法的主要步骤包括:(1)通过反转录合成cDNA第一条链,通过置换底物的方式ceDNA 3'末端合成接头序列.(2)利用cDNA两端的接头引物,通过Taq DNA合成酶PCR扩增合成cDNA第二条链.(3)将PCR产生的双链cDNA直接与T-载体连接.(4)将连接物转化大肠杆菌,得到cDNA文库.利用本方法,我们成功构建红树植物红海榄的cDNA文库.PCR结果显示插入的片段分布在0.5～3.0 kb之间,大部分cDNA的长度在500～1000bp之间,表明cDNA具有较好的完整性.本方法具有操作简单、高效率、低成本、RNA 模板需要量少的特点,而且适用于任何高等生物RNA样品.【总页数】5页(P71-75)【作者】徐远峰;黄文峰;高艳梅;翟金玲;黄惜【作者单位】海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228;中国热带农业科学院橡胶栽培研究所,海南儋州,571737;海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228;海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228;海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口,570228【正文语种】中文【中图分类】O641.3【相关文献】1.一种构建全长cDNA文库的方法 [J], 刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨2.一种改进的小非编码RNA cDNA文库构建方法 [J], 杜光石;罗发涛;肖燕;陈红军;吴传芳3.一种构建 cDNA 文库时 Sepharose CL-4B 筛分 cDNA 的简化方法 [J], 汪洛;张迺蘅4.一种简单快速的cDNA文库构建方法 [J], 赵艳景;胡亚楠;王颖;刘睿;叶波平;王旻;吴梧桐5.一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法 [J], 董志敏;李英慧;张宝石;关荣霞;常汝镇;邱丽娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
总RNA提取,cDNA第一条链合成,cDNA纯化,3‘端加尾实验,荧光定量PCRprotocol
RNA Extraction Protocol1.实验原理异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织1. 样品裂解2. 分离总RNA2.实验试剂与器材2.1实验试剂RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。
2.2实验器材微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。
3.实验前准备工作实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。
提前20min打开低温离心机预冷。
准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。
4.实验步骤4.1取样（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书
第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************1红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.22无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)4黄色/紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。
反转录试剂盒介绍及使用说明
USuperRT cDNA KitSuperRT cDNA 第一链合成试剂盒Cat. No.WD3126保存：-20℃组分说明产品简介本产品包含从RNA 模板逆转录成cDNA 第一链所需的所有试剂，其中包括高效逆转录酶、反应缓冲液、引物、dNTP等。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更易获得全长的cDNA。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA。
适用于第一链cDNA 的合成、RT-PCR、Real-Time PCR 以及全长cDNA 文库的构建等。
注意事项1.在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并高压灭菌30分钟后使用。
2.本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
3.若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。
本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购.使用方法注意：1 ng-5 µg总RNA可建立20 µl反应体系，如果总RNA量大于5 µg，请按比例扩大反应体系。
ⅰ逆转录操作步骤：1.将RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT 和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。
2.根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。
注意：若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）本试剂盒并未提供，。
cdna合成的基本原理
CDNA合成的基本原理介绍CDNA合成是一种常用的分子生物学技术，用于将RNA转录本转化为相应的DNA序列。
本文将详细探讨CDNA合成的基本原理及其在生物研究中的应用。
一、CDNA合成的步骤CDNA合成通常包括以下几个主要步骤：1. RNA提取首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
RNA提取的方法有很多种，常用的包括酚-氯仿法和商用RNA提取试剂盒。
2. 反转录反应反转录反应是将RNA转录本转化为相应的DNA序列的关键步骤。
该反应通常在逆转录酶的作用下进行。
逆转录酶能够将RNA模板上的核酸序列转录成互补的DNA链。
3. DNA合成在反转录反应中，逆转录酶合成的第一链cDNA是由RNA模板的互补链合成的。
为了合成双链cDNA，需要在反应体系中加入DNA聚合酶和dNTPs。
4. 纯化和放大合成的cDNA需要经过纯化和放大，以获得足够的量用于后续实验。
纯化通常通过凝胶电泳、酶切和PCR等方法进行。
二、CDNA合成的重要考虑因素在进行CDNA合成时，需要考虑以下几个重要因素：1. RNA模板的选择在CDNA合成之前，需要选择适当的RNA模板。
RNA模板的选择应根据研究的目的和样本的特性来确定。
不同类型的RNA模板可能需要不同的反转录酶和反应条件。
2. 反转录酶的选择逆转录酶是CDNA合成的关键酶，不同的逆转录酶具有不同的特性。
例如，一些逆转录酶具有RNA依赖性DNA聚合酶活性，可以直接合成双链cDNA，而其他逆转录酶则需要额外添加DNA聚合酶。
3. 反应条件的优化反转录反应的条件需要根据具体实验进行优化。
反应温度、反应时间、逆转录酶和dNTPs的浓度等因素都可能影响CDNA合成的效率和准确性。
4. RNA降解的控制RNA在提取和合成过程中容易受到降解的影响。
为了避免RNA降解对CDNA合成的影响，可以在提取过程中添加RNase抑制剂，并在合成过程中加入RNase H来降解RNA模板。
三、CDNA合成的应用CDNA合成在生物研究中有广泛的应用，包括以下几个方面：1. 基因表达分析CDNA合成可以用于基因表达分析。
ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR
产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
cDNA第一链的合成
cDNA合成1. cDNA第一链的合成1.1 取一个0.2 ml 薄壁管，于冰浴上加入：混匀，短暂离心收集液滴至管底。
1.2 72°C温育2分钟后，冰浴2分钟并短暂离心收集液滴至管底。
1.3 在管中冰浴按下列顺序加入：混合后离心5 秒钟，置冰上备用。
1.4 GeneAmp 2400 PCR仪上42°C温育1小时。
注：若使用水浴进行温育，应在反应混合物上覆盖一滴石蜡油以防止水分蒸发。
1.5 取出管子置于冰浴上中止反应。
若不进行下一步，则将产物冻存于-20°C。
2. LD PCR扩增cDNA双链2.1于冰浴上在0.2ml薄壁管中加入：混匀后，短暂离心收集液滴至管底。
根据表1的数据确定PCR循环数。
2.2 GeneAmp 2400 PCR仪上进行PCR反应，参数为：· 95°C 1min· 22次循环：95°C 15sec68°C 5min3. 双链cDNA补平反应3.1 每50μl扩增好的双链cDNA加2μl浓度为20μg/μl的蛋白酶K，混匀后45°C温育1小时，短暂离心后置于90°C，10分钟以灭活蛋白酶K。
3.2 将离心管冰浴2分钟，加入3μl（15 units）T4 DNA聚合酶，16°C反应30分钟。
3.3 72°C，10分钟灭活酶，加入27.5μl，4 mol/L醋酸铵，再加入210 μl 95％的乙醇，颠倒管子数次混匀溶液。
3.4 立即于室温，14,000 rpm条件下离心20分钟（离心前不要将管子置于冰浴，否则会有杂质的共沉淀）。
小心弃上清，用80％乙醇洗涤沉淀一次。
3.5 室温干燥沉淀，用19μl水重溶。
4. 接头与cDNA的连接4.1 在3中第5步得到的重悬液中加入：混匀后，短暂离心收集液滴至管底。
16°C连接过夜。
4.2 加入3μl，0.2mol/L EDTA中止反应。
cDNA第一链合成试剂盒
cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。
（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。
2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。
94℃预变性 2.5min 。
进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。
最后 72℃延伸 7min。
注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。
cdna第一链合成所需要的引物
cdna第一链合成所需要的引物CDNA合成是一种在实验室中合成DNA的技术。
在合成CDNA的过程中，引物起着关键的作用。
引物是一种短链DNA或RNA序列，其序列与目标RNA 的反义序列互补。
通过引物的互补配对，CDNA链可以在反转录过程中产生。
在合成CDNA第一链时，需要使用两种引物，即逆转录引物和OLIGO（dT）引物。
逆转录引物是在典型的CDNA合成反应中使用的第一个引物，它通常由RNA 依赖的DNA聚合酶（例如M-MLV逆转录酶）合成。
逆转录引物的设计应囊括目标RNA的起始位点，以确保所有目标RNA分子都能够转录成CDNA。
OLIGO（dT）引物是用于合成mRNA的CDNA的第二个引物。
它是一种具有多个连续脱氧胸腺嘧啶（dT）的短链DNA序列。
这种引物通过与目标mRNA 的多聚腺嘌呤尾部互补，从而将其用作合成CDNA的起始点。
在实际实验中，通常会使用反转录引物和OlIGO（dT）引物的混合物来合成CDNA的第一链。
这是因为许多mRNA分子的5'端没有腺嘌呤残基，所以OLIGO（dT）引物无法与它们互补。
因此，在使用OLIGO（dT）引物无法反转录mRNA分子的情况下，反转录引物可以用于产生CDNA的第一链。
此外，在CDNA合成的过程中，还需要引物包含其他特定序列，以便于在后续实验中对CDNA进行扩增、检测等操作。
例如，引物的末端通常含有限制酶切位点，以便将CDNA放入载体中。
此外，引物还可以带有一组序列标签，如荧光标签或亲和标签，以便实现CDNA的可视化或纯化。
总结起来，合成CDNA第一链所需的引物包括逆转录引物和OLIGO（dT）引物，它们的序列应与目标RNA互补。
合成CDNA的引物设计应考虑目标RNA的特点，并可能包含特定的序列标签或限制酶切位点。
引物的选择及其设计对于成功合成CDNA的第一链至关重要，因此需要进行仔细的序列分析和合成策略的考虑。
诺唯赞反转录试剂盒 说明书
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•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit是一套用于以RNA为模板高效合成第一链cDNA的完整系统，可合成长达13kb 的cDNA。
试剂盒配套提供的RiboLockRNase Inhibitor，可有效防止RNA模板的降解。
试剂盒配套提供oligo(dT)18引物和随机六聚体引物。
oligo(dT)18引物可以选择性地与mRNA中的poly (A)尾结合。
随机六聚体引物无需poly (A)尾，因此可转录mRNA 5’-端区域，也可以无poly
(A)尾的RNA (如micoRNA)为模板合成cDNA。
该试剂盒也可使用基因
特异性引物。
•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明优点：
•合成全长的第一链cDNA，最长可合成13kb的cDNA
•最佳反应温度为42℃
•完全一提供RT反应所需的所有组分
•应用:
•第一链cDNA合成，作为RT-PCR和实时RT-qPCR的模板
•构建全长cDNA文库
•反义RNA合成
•Thermo 反转录试剂盒K1622使用说明
•RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成全长cDNA
• 1 μg小鼠心脏总RNA作为模板，用oligo(dT)18 引物进行逆转录反应。
由此合成的cDNA，再作为Taq DNA Polymerase后续PCR扩增的模板。
末端2024 bp片段的成功扩增，表明长度为13.8 kb的全长RN***段得到成功的逆转录。
•。
RNA逆转录成cDNA操作要领
RNA逆转录实验材料实验器材：PCR管，去RNA酶枪头，PCR仪，掌上离心机及振荡器试剂：DEPC水，逆转录试剂盒（本实验室使用兰博利德First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover试剂盒，货号F0201）实验步骤：将模板RNA在冰上解冻；LabScript RT Mix、2×RT Reaction Mix（With Primer ）、gDNA Remover、5×gDNA Remover Reaction Mix、DEPC-ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。
使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进行。
为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
1.去除RNA中基因组DNA残留：组分体积RNA模板≤1 µg total RNA 或≤0.1 µgpoly(A) mRNA5×gDNA Remover Reaction Mix 1.6 µlgDNA Remover0.5 µlDEPC-ddH2O补足至8 µl混匀，并短暂离心，反应条件为 37℃，5 min。
2.在上述的反应管中，直接添加如下的反转录反应所需组分，进行第一链 cDNA 的合成步骤：组分体积gDNA Remover处理后RNA样品8 µl2×RT Reaction Mix（With Primer）10 µlLabScript RT Mix 1 µlDEPC-ddH2O补足至20 µl3.轻轻混匀，短暂离心；42℃孵育 15-30 min。
4.85℃加热 5 min 失活LabScript RT Mix。
5.反应结束后所得的cDNA，请置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
cdna_synthesis_kit
0.2-2 μg 1 μl 1 μl 4在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:
30°C
5min
42°C 30-40min
95°C
5min
4°C
产品组分
组分名称 M-MuLV 反转录酶 (200 U/μl) 5XRT PCR Buffer dNTP Mixture (10 mM each) Rnase Inhibitor (40 U/μl) Oligo (dT)15 Primer (20 μM)
cDNA 第一链合成试剂盒 1st cDNA Synthesis Kit
使用说明书
Cat. No.: D0401 包装量：50次
产品说明
本试剂盒采用莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶M-MuLV ，该酶通过点突变使RNase H活性缺失，而保持完全的 mRNA-directed DNA多聚合活性，有效增强了cDNA的 合成效率、增加了该酶与模板/引物的亲和力, 从而增 加了酶的活性和持续合成能力。本试剂盒优化了反应 Buffer，能使反应的模板量（Total RNA）可在0.2-2 μg 范围之间进行逆转录反应。cDNA合成后进行PCR扩增 既可检测到长cDNA（>10 kb）片段，也可检测到低丰 度cDNA样品。本试剂盒提供了由Total RNA或mRNA合 成cDNA第一链所需要的全部试剂，并提供两种cDNA合 成引物。合成的第一链cDNA可广泛用于2nd Strand的合 成、杂交、PCR扩增、Real-Time PCR反应等。
Rnase Free H2O
储存条件
-20°C保存，避免反复冻融。
数量 50 μl 250 μl 50 μl 25 μl 50 μl
1 ml
操作方法
1．按以下组分配制反转录反应液
31cDNA第一链的合成
3.1 cDNA第一链的合成1)在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mRNA各2ug(2-4ul)，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：5×First-strand Buffer 2uldNTPs Mix(10mM) 1ulsterile H2O 1ulAMV Reverse Transcriptase(20U/ul) 1ul2)42℃反应1.5hr.，然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。
3.2cDNA第二链的合成1)在已经合成好cDNA第一链的离心管中每管加入如下反应物，16℃反应2hr：sterile H2O 48.4-50.4 ul5×Second-strand Buffer 16.0uldNTPs Mix(10mM) 1.6ul20×Second-strand Enzyme Cocktail 4.0ul2) 混匀, 16℃反应2hr3)加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
4)加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
5)加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,离心14000rpm/10min,吸取上清到一新的1.5ml的离心管中,加入100ul氯仿:异戊醇(24:1)离心 14000rpm/10min,吸取上清到一新的1.5ml的离心管中,加入40ul4MNH4Oac和300ul95%的乙醇离心14000rpm/20min倒去上清,向离心管中加入500ul的乙醇, 离心 14000rpm/10min 倒去上清,放置10min,使剩余的乙醇挥发调,溶解于50ul双蒸水中。
3.3cDNA质量检测根据目的基因Ccl1(GI:1694628)的cDNA序列设计特异性引物（CF：5′-…………………-3′ CR：5′-…………………….-3′），目标片段大小为nbp。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
提RNA反转录的详细流程
提RNA反转录的详细流程SMART 技术制备GS FLX 样品cDNA详细流程第一天一．RNA的提取1.用QiagenRneasy Mini Kit 提取组织总RNA(详见Handbook)：1）在1.5 ml管中加入600ulRL T和6ul B-巯基乙醇2）取10—30mg组织样品放入管中，用剪刀或电动匀浆机破碎，3—5min3）12000rpm/3min,取上清移入新管4）加入1倍体积70%乙醇，轻柔混匀（吸打），不能离心，并立即转入收集柱，10000rpm/30s,弃废液。
(分两次移吸附柱，离心弃废液后，打开盖子让酒精挥发一下再操作)5）加入700ulRW1, 10000rpm/30s,弃废液6）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液7）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新收集管，空转12000rpm/1min8）将收集柱移入1.5mlRnase-free管中，加30—50ulRnase-free water,静置1min,10000rpm/1min..(由于下步用Dnase去除DNA,需用87.5ul RNA溶液，因此用45ul Rnase-free water洗两次) 9）定量，跑胶2.用Tiangen Rnase-Free Dnase I 去除DNA 污染1）反应体系：共100ul87.5ul RNA 溶液10ul buffer RDD2.5ul Dnase I储存液（配制：干粉溶于550ul的Rnase-Free ddH20中，分装，-20℃保存）2）20—25℃孕育10min3.用Qiagen Rnwasy Mini Kit 纯化1）100ul除DNA后的RNA+350ulRL T,混匀2）加入250ul无水乙醇，轻柔混匀，不能离心，并立即移入收集柱，10000rpm/30s，弃废液3）加入500ulRPE, 10000rpm/30s,弃废液4）加入500ulRPE, 10000rpm/2min,弃废液，换新的收集管，空转1min5) 换 1.5ml管，加30—50ulRnase-free water，置1min,10000rpm/1min6）定量，跑胶第二天二．反转录（SMART Kit,详见Manual）1.做逆转录之前对RNA的处理：浓缩RNA1）在所提取的RNA里（大约为10ug），加无水乙醇（2倍体积），醋酸钠（3M. PH=15.2 0.1倍体积）2）-70℃, 酝酿40min或过夜.3）取出溶液，3000g/1min; 换个方向，12000rpm/5min4）弃上清，用70%的乙醇洗两次。
第六课 反转录合成cDNA第一链
共计 注意： • Total RNA的使用量小于2.5ug • Poly(A) RNA的使用量小于0.5ug
2.
在PCR仪上进行下列反应：
① ② 65 ℃ 5min 立即置冰上
实验步骤
3. 在另一无RNase的薄壁PCR管中配置下列混合液
① ② ③ ④ 5X PrimeScript Buffer RNase Inhibitor (40U/ul) PrimeScript RTase (200U/ul) RNase free H2O 共计 2 ul 0. 25 ul 0.5 ul 2.25 ul 5 ul
实验试剂
5X PrimeScript Buffer 3. RNase Inhibitor (40U/ul)
4. 5. 6. 7. 8. dNTP Mixture (10 mM each) Oligo dT Primer (50 uM) Random 6 mers (50 uM) Total RNA RNase free H2O
第六课
反转录合成cDNA第一链
实验目的
1，学习反转录cDNA第一链的原理 2，通过反转录合成目的基因的cDNA第一 链
实验原理
• 反转录酶的特性 ① 具有RNA指导的DNA聚合酶活性，即：以RNA为模板， 脱氧核苷三磷酸为底物，从 5’- 到 3’- 合成 DNA，反应 需要引物 ② 具有DNA指导的DNA聚合酶活性 ③ 有RNase H活性，即降解RNA-DNA杂交分子的单链RNA 的活性 ④ 不具有3’到5’校正功能 • 反转录酶主要有 ① 莫洛尼氏小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶 ② 鸟类的禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶 ③ 嗜热微生物的耐高温病毒反转录酶 • PrimeScript RTase是TaKaRa公司开发的RNase H-型反转录 酶，具极强的延伸能力，可合成12kb的cDNA第一链，即使 对具有复杂二级结构的RNA，在42℃条件下也能得到良好的 反转录效果。 • cDNA第一链可用于： cDNA第二链的合成，杂交，PCR扩增， Real Time PCR等反应。
反转录的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习反转录技术的原理和操作方法；2. 掌握从RNA模板合成cDNA的第一链的方法；3. 熟悉反转录试剂盒的使用。
二、实验原理反转录（Reverse Transcription）是指将RNA模板逆转录成cDNA的过程。
反转录酶是一种RNA指导的DNA聚合酶，可以在RNA模板的指导下合成cDNA。
反转录技术在分子生物学研究中具有重要作用，如基因克隆、基因表达分析等。
三、实验材料1. 实验试剂：反转录试剂盒、RNA提取试剂、DEPC水、引物、dNTPs、RNase抑制剂等；2. 实验仪器：离心机、PCR仪、恒温水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统等；3. 实验样本：含有目的RNA的细胞或组织。
四、实验步骤1. RNA提取：按照RNA提取试剂说明书操作，提取细胞或组织中的RNA；2. RNA浓度测定：使用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度；3. 反转录反应：按照反转录试剂盒说明书进行操作，将提取的RNA作为模板，在特定条件下合成cDNA第一链；4. cDNA纯化：使用柱式或磁珠纯化cDNA，去除未反应的RNA、dNTPs、RNase抑制剂等杂质；5. PCR扩增：将纯化的cDNA作为模板，进行PCR扩增，验证反转录结果；6. 电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
五、实验结果与分析1. RNA提取：成功提取出目的RNA，A260/A280比值在1.8-2.2之间，表明RNA纯度较高；2. cDNA合成：反转录反应完成后，在特定条件下进行PCR扩增，成功扩增出目标片段；3. 电泳检测：PCR产物在琼脂糖凝胶上呈现清晰的条带，表明反转录和PCR反应均顺利进行。
六、实验结论1. 成功从RNA模板合成cDNA的第一链，为后续的基因克隆、基因表达分析等研究提供了基础；2. 反转录技术操作简便，结果可靠，适用于分子生物学研究。
七、实验注意事项1. 实验操作过程中应避免RNA降解，使用DEPC水处理实验器材和试剂；2. 操作过程中应严格按照试剂说明书进行，避免人为误差；3. 实验结果可能受到RNA质量、反转录酶活性、引物设计等因素的影响，需进行多次实验验证。
逆转录-聚合酶链(RT-PCR)实验的具体步骤及方法
逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
一、总RNA的提取见总RNA的提取相关内容。
二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。
在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。
2. 第一链cDNA合成(反转录)
cDNA合成
一. 普通cDNA合成
普通cDNA第一链合成使用Fast Quant RT Kit(TIANGEN)，具体如下：
1. Microtube 管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量
2.5 μl；
2. PCR仪中42℃保温3 分钟后迅速在4度急冷2 分钟以上；
3. 在上述Microtube 管中配制下列反转录反应液Mix2.5ul；
4将反转录中反应中的Mix,加到gDNA 去除步骤的反应中，充分混匀，总体系5ul。
5.42℃孵育15Min。
6.95度孵育3min后放于冰上或4度，得到的cDNA可用于后续实验
二. microRNA cDNA第一链合成
按照天根miRNA第一链合成试剂盒（KR211）进行操作，具体如下：
（a）miRNA 3' 末端进行加Poly (A)处理
1. 在冰上预冷RNase Free 的反应管内加入以下试剂至总体积5 μl (最后加入
E.coli Poly(A) Polymerase)
*在反应中使用的Total RNA 必须含有小分子RNA.
此过程也可以使用小分子RNA（建议加入量为1-2 µl。
请根据目的miRNA 丰度决定加入量）。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在PCR仪中42℃反应60 min,95度3min，4度急速降温。
所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存。
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RT延伸。
注意事项
1. 下列操作步骤适用于模板量为50 ng-2 μg的总RNA，如果总RNA量大于2 μg，请按比例扩 大反应体系。
2. 在冰上进行操作，防止RNA发生降解。 3. 不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步
KR116-0μl 25 μl 50 μl 1 ml
KR116-02 (100 rxn)
200 μl 200 μl 100 μl 200 μl 2×1 ml
KR116-03 (1000 rxn) 10×200 μl 10×200 μl 10×100 μl 10×200 μl 10×2×1 ml
操作步骤
使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
50 ng-2 μg总RNA可建立20 μl反应体系。
1. 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、 RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液 涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配 制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育 3 min。然后置于冰上放置。
表1 gDNA去除反应体系
组成成分
使用量
5×gDNA Buffer
产品特点
反转录效率高：反转录效率可达95%以上； 操作简单快速：反应体系配制简单，21 min完成cDNA第一链的合成； 通读复杂模板：能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板； 样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高； 后续兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。
解模板RNA，最后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。 2. 模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响逆转录
酶的活性，最后影响逆转录结果。 3. 模板的加量：以下操作步骤适用于模板RNA量为50 ng-2 μg，如果模板RNA的量大于2
μg，请按比例扩大反应体系。 注意 1. 若后续实验为实时荧光定量PCR，逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，
产品简介
FastKing cDNA第一链合成试剂盒是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组DNA污染 的反转录系统。本试剂盒含有高效去除基因组DNA的gDNase；通过42℃，3 min即可去除 gDNA，有效避免Total RNA中基因组DNA的干扰。本试剂盒所含的高效反转录酶FastKing RT Enzyme，是通过分子改造后的新型反转录酶，特别增加了疏水motif，具有更强的RNA 亲和性和热稳定性，从而进一步提高了其反转录效率和反应速率，42℃、15 min即可完成 cDNA第一链的合成。另外，由于新型酶与RNA亲和力的增强，使其在通读GC含量高，二级 结构复杂的RNA模板和抗逆性等方面的表现也更为的突出。
例如50 μl的PCR反应体系，逆转录产物的加量应不超过5 μl。 2. 将逆转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应；如果需要长时间保存，请置于-20℃。
版本号: KR180123
Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD
2 μl
Total RNA
-
RNase-Free ddH2O
补足到10 μl
3. 按照表2的反转录反应体系配制混合液。
表2 反转录反应体系
试剂
使用量
10×King RT Buffer
2 μl
FastKing RT Enzyme Mix
1 μl
FQ-RT Primer Mix
2 μl
RNase-Free ddH2O
补足到10 μl
4. 将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。 5. 42℃，孵育15 min。 6. 95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。
对RNA模板的要求
逆转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA，模板RNA的质量和数量直接影响逆转录的结 果。 1. 模板的完整性：模板RNA的完整性对逆转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降
FastKing RT Kit (With gDNase) FastKing cDNA第一链合成试剂盒
（去基因组）
目录号：KR116
产品内容
产品组成
5×gDNA Buffer FQ-RT Primer Mix FastKing RT Enzyme Mix 10×King RT Buffer RNase- Free ddH2O
储存条件
该试剂盒使用干冰运输，-20℃可保存一年。
本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5 min后迅速转移到冰上，进行下一步操 作。 4. 根据实验需求不同，也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量如下： Oligo-dT Primer 50 pmol / 20 μl 反应体系，Gene Specific Primer 5 pmol / 20 μl 反应体系。 5. 使用Gene Specific Primer时，反转录反应可设置为42℃，15 min。当PCR反应有非特异 性扩增时，将反转录温度升到50℃会有改善。 6. 反转录体系可以根据需要相应扩大。