逆转录试剂盒( transcriptor first strand cdna synthesis kit )操作步骤

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录步骤

1，使用前解冻结冰的试剂

2，将试剂短暂离心

3，冰上操作：（操作RNA实验需要戴手套）

将模板与引物在PCR管上混合

试剂体积最终浓度

细胞总RNA 或 1 ug 总RNA 或10ng

多聚尾(A)+m RNA 多聚尾(A)+ mRNA

任选其中一个引物:

Anchored-oligo(dT)18 Primer, 1 ul 2.5 uM

50 pmol/ul (vial 5)

或Random Hexamer Primer, 2ul 60uM

600 pmol/ul (vial 6)

或 Sequence-Specific Primer 可变0.5-2.5 uM

1%DEPC水, (vials 7 or 9) 可变使总体积为 13 ul

总体积13ul

注：以上为初次实验的推荐浓度。总RNA的适用浓度为10ug到5ng，

以及mRNA的适用浓度为1到100ng,当RNA模板浓度较低时添加10ug/ml 的MS2 RNA* 来稳定模板RNA。

4，（可选）65度水浴上述混合物10分钟，使模板引物混合物变性（确

保失活RNA二级结构），水浴后立即冰浴至少一分钟

5，往上述混合物继续加入以下试剂（冰上操作）

试剂体积最终浓度.

Transcriptor Reverse Transcriptase 4 ul 1×(8 mM MgCl2) Reaction Buffer, 5× conc. (vial 2)

Protector RNase Inhibitor, 0.5 ul

40 U/ul (vial 3)

20 U Deoxynucleotide Mix, 2 ul 每个1 mM 10 mM each (vial 4)

Transcriptor Reverse 0.5 ul 10U Transcriptase, 20 U/ul (vial 1)

最终体积20 ul

注：小心混合上述试剂，不要振荡，短暂离心使试剂沉在管底6，将PCR管放在PCR仪上孵育，孵育条件如下：

使用的引物目标mRNA长度孵育温度与时间Anchored-oligo(dT)18 不大于4kb 55度30分钟

大于4kb 50度60分钟

primer, 50 pmol/ul 或

Sequence–specific primer

Random hexamer primers, 不大于4kb 25度10分钟，然后55度

30分钟

600pmol/ul 大于4kB 25度10分钟，然后50度

60分钟

6,85℃水浴5分钟灭活逆转录酶

8、－20℃保存，或立即进行PCR。

注：Random hexamer primer: 主要用于细胞总RNA的逆转录

A anchored-oligo(dT)18 primers ：主要用于多聚尾(A)+m RNA的逆转录