通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)
一步法RT-PCR试剂盒使用说明书
一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒)(目录号HS0612-2)产品包装保存条件-20℃产品简介本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。
PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。
独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。
使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。
北京厚生博泰科技有限公司Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2. 耐热性及稳定性强。
3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。
4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用方法1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。
RT-PCR
通用RT-PCR试剂盒本试剂盒适用于以RNA为模板合成第一链cDNA的反转录，以及后续的PCR扩增实验。
本试剂盒选用优异的M-MLV RT酶，可以合成大于5kb的第一链cDNA；反转录过程中的特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。
反转录反应1、每次RT反应中，按下表加入各组分：RNA模板0.5-2μgOligo(dT)15 1μlRNase-free H2O 补齐至10 μl2、70℃放置5分钟，然后迅速置于冰上5分钟。
3、顺次加入如下组分：M-MLV 5×Buffer 4μldNTPs(10mM) 1μlRNase Inhibitor 0.5μlM-MLV RT 1μlRNase-free H2O 3.5μl4、37℃反应1小时。
5、75℃孵育15分钟终止反应，保存于-20℃或直接用于下游实验。
RNase Inhibitor(Ribonuclease Inhibitor) 即RNases抑制剂，是一种大肠杆菌表达的重组蛋白，可以通过非竞争性方式按1:1比例和RNase A、RNase B或RNase C结合，并抑制这三种酶的活性，保护RNA不被这三种酶降解。
但本RNase Inhibitor不能抑制RNase I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。
Oligo(dT) 生化术语，是指多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。
因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。
因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录。
PCR反应1、取上述产物1μl作为50μl PCR反应体系模板；若待测基因丰度高，可适当稀释模板。
10×Taq Buffer 5μlDNA模板1μldNTPs(10mM) 1μlPrimer ⅠPrimer ⅡTaq酶1μlH2O 补齐至50μl2、PCR程序：95℃3分钟95℃30秒退火温度45秒72℃根据所扩增片段大小调整（1kb/分钟）(以上三步循环30次)72℃ 10分钟3、所得产物可直接用于下游分子生物学实验或冻存于-20℃保存。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
rt-pcr的原理应用
RT-PCR的原理应用什么是RT-PCRRT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因检测技术，广泛应用于分子生物学和医学领域。
它可以在样本中检测到特定的RNA序列，并且是定量检测RNA的一种常用方法。
RT-PCR结合了反转录（Reverse Transcription）和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）两个步骤。
RT-PCR的原理RT-PCR首先将RNA反转录为互补的DNA模板，然后通过聚合酶链反应增加DNA模板的数量。
整个过程分为三个主要步骤：反转录、PCR扩增和检测。
1.反转录：RNA在反转录过程中被逆转录酶（reverse transcriptase）转录成DNA。
这个过程使用一些反向引物（reverse primer）和dNTPs（脱氧核苷三磷酸）来帮助反转录酶合成DNA链。
最常用的反转录酶是M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）逆转录酶。
2.PCR扩增：在反转录完成后，使用特定的引物（primer）将目标DNA序列扩增。
引物是一小段DNA片段，它可以与目标DNA序列的两端序列互补，并作为DNA聚合酶合成新的DNA链的起始物。
PCR过程包括循环加热和降温的步骤，以便在每个循环中将DNA复制一次。
通过PCR扩增，可以快速扩增目标DNA序列的数量。
3.检测：扩增的DNA可以通过凝胶电泳、荧光染料或实时荧光PCR等方法进行检测。
凝胶电泳是一种常用的检测方法，可以通过电泳将DNA片段分离并可视化。
荧光染料可以与DNA结合，通过荧光信号来检测DNA的存在。
实时荧光PCR可以实时监测扩增反应的进行，并通过荧光信号的变化来测量样本中特定序列的数量。
RT-PCR的应用RT-PCR广泛应用于生物医学领域，尤其是在病毒检测、基因表达分析和研究等方面起着重要作用。
1.病毒检测：RT-PCR可以用于检测病毒的存在和定量分析。
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
takara反转录试剂盒说明书
takara反转录试剂盒说明书Takara反转录试剂盒是一种用于研究RNA分子的试剂盒。
该试剂盒可以用于DNA的反转录，将RNA转录成DNA，并进行后续的PCR扩增。
反转录试剂盒在生命科学领域中起着非常重要的作用，因此在使用过程中需仔细阅读说明书并按照说明书进行操作。
一、试剂盒组成Takara反转录试剂盒主要包含以下拉玛：1.反转录酶：外源的M-MLV反转录酶，具有高度的反转录活性和优异的扩增效率等优良特性。
2.反转录缓冲液：针对反转录酶的酶切优化反转录缓冲液。
3.引物：随机9mers引物，适用于多种RNA逆转录的应用。
4.对照RNA：In Vitro转录的任意序列的RNA，用于反转录和后续PCR扩增反应的质控。
二、试剂盒使用方法1. RNA提取：在使用Takara反转录试剂盒之前，需要从样品中提取RNA。
2. 反转录反应：将RNA测序专用随机引物、针对反转录酶的反转录缓冲液、反转录酶和RNA样品混合，进行逆转录反应。
3. PCR扩增：反转录完成后，可以利用PCR扩增技术对转录所得DNA进行扩增，完成DNA序列的检测和分析。
三、试剂盒注意事项1. 避免多次冻融。
为保证试剂的稳定性，反转录试剂盒必须储存于-20℃及以下的冰箱中，避免多次冻融。
2. 操作时需佩戴手套。
操作时需佩戴手套，尽量避免手汗或皮脂的污染，影响试剂盒的效率和准确性。
3. 注意反转录缓冲液的稀释量。
反转录缓冲液的稀释量会影响反转录效果，因此需要按照说明书进行操作，精准稀释。
4. 注意反转录酶的用量。
不同反转录酶的最优用量不同，需要根据实验需要按照说明书或文献进行调整。
5. 确认对照RNA引物的扩增效果。
在进行PCR扩增前，需要先进行对照RNA引物的扩增，以确认反转录反应的正确性，避免因为反应偏差而引起的实验结果的偏差。
4. 根据实验需要进行调整。
反转录试剂盒虽然具有大量的优良特性，但是实验环境和实验条件的不同，会对反转录试剂盒的效果产生较大的影响，因此需要根据实验需要进行调整。
abclonal的pcr逆转录的说明书
abclonal的pcr逆转录的说明书Abclonal 是一家提供各种生命科学试剂和服务的公司，其中包括逆转录PCR（RT-PCR）试剂。
RT-PCR 是一种将RNA转化为DNA的过程，常用于检测和量化特定RNA的表达。
以下是一份Abclonal RT-PCR 试剂的使用说明书的大致内容。
一、实验目的本实验的目的是使用 Abclonal 的 RT-PCR 试剂，逆转录特定 RNA，以便进行后续的定量或定性分析。
二、实验原理逆转录PCR (RT-PCR) 是一种用于检测和量化特定RNA分子的技术。
首先，使用逆转录酶将RNA分子转化为cDNA。
然后，使用PCR技术扩增cDNA，以便进行后续分析。
Abclonal 的RT-PCR 试剂盒包含所有必要的酶和引物，以方便用户进行此实验。
三、所需材料1. Abclonal RT-PCR 试剂盒2. 逆转录酶 (如 M-MLV 或 SuperScript III)3. 随机引物或特异性引物4. RNA样品5. 热稳定DNA聚合酶 (如 Taq DNA 聚合酶)6. dNTPs (脱氧核苷酸)7. 缓冲液和稳定剂8. 离心管和移液器9. 离心机和PCR仪（如果需要）四、操作步骤1. 准备RNA样品：将RNA样品按照标准方法进行分离和纯化。
确保RNA 的质量和浓度适合后续的逆转录和PCR反应。
2. 逆转录：将RNA、缓冲液、dNTPs、随机引物和逆转录酶混合在一个离心管中。
按照试剂盒说明书的指示进行逆转录反应。
3. PCR扩增：将逆转录产物、PCR缓冲液、dNTPs、特异性引物和热稳定DNA聚合酶混合在一个离心管中。
按照试剂盒说明书的指示进行PCR反应。
4. 分析结果：对PCR产物进行电泳、荧光检测或其它适当的分析方法，以确定目标RNA的表达水平。
五、注意事项1. 请遵循所有试剂盒和酶的操作说明，以确保实验的准确性和安全性。
2. 在处理RNA时，要特别注意防止其降解和污染。
东盛生物 RT-PCR Kit（逆转录试剂盒） 说明书
0.6 μl RNasin , M-MLV ； 按下列条件进行反转录反应 42℃ 温浴 60 min（随即引物 37℃ 温浴 60 min） ； 5 终止反应 70℃ 温浴 5 min 终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃ 保存。 6 用 RNase-free ddH2O 将反应体系稀释到 50 μl ，取 2-5 μl 进行 PCR 扩增反应。
20 次逆转录反应，R1012 可进行 100 次逆转
录反应（20 μl 标准 PCR 反应体系，每次使用 M-MLV 1 μl）。
M-MLV 储存液 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 200 mM NaCl 0.1 mM EDTA 1 mபைடு நூலகம் DTT 0.01% NP-40 50% glycerol 5xfirst-strand buffer 成分 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ℃) 375 mM KCl 15 mM MgCl2 50 mM DTT 保存条件 各组分均-20℃保存，避免反复冻融。
●
在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNase 抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲
液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A，B，C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase，因此尽管使用了这些抑 制剂，也要小心不要从手指上引入 RNase。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------广州东盛生物科技有限公司 电话：020-87791356 传真：020-87791381 网址：
RT PCR的具体步骤
RT PCR的具体步骤rt-pcr的具体步骤rt-pcr实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.ep管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，摆75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：外盖，稍大二．实验器具处置1.塑料制品：(包括枪头、ep管、匀浆管等)先将depc水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入depc水)，过夜后取出(注意：depc水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的depc物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，ep管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。
高压后烤干备用。
如果depc处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗整洁，先泡1‰d epc过夜，再塞锡纸烤干水泵。
3.匀浆器：(包含剪刀、镊子)先晒干后，超音波消毒即可(不须要泡depc)。
三．试剂酿制1．depc水：吸出1mldepc放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰depc水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+depc水分体式，然后摆-20℃留存(depc水需先高压，高压时特别注意：1.装depc水的瓶子在盖子和瓶之间Though上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适度多加一点；3.高压完结后，不要私自换气，必须使压力自然上升，不然水会燃烧)。
3．异丙醇：放进棕色瓶中。
4．乙醚：放进棕色瓶中。
5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×tbe储藏液)：tris54g、硼酸27.5g、0.5medta20mlph8.0、加蒸滚水至1000ml。
通用反转录试剂盒(M-MLV)使用说明
通用反转录试剂盒(M-MLV)使用说明货号：RP1105规格：50T/100T保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为1年。
产品内容：试剂盒组成50次100次M-MLV(200U/μL)50μL50μL×25×M-MLV Buffer200μL400μL(10uM)100μL200μLOligo(dT)16RNasin(40U/μL)25μL50μLdNTPs(10mM)50μL100μLO1mL1mL×2RNase-free ddH2说明书1份1份产品简介：通用反转录试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应。
它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物用于后续的PCR扩增和分子克隆实验。
通用反转录试剂盒中配置的酶为进口的酶。
RT酶采用进口的M-MLV，所以cDNA更长，基因的信息保留得更完整！反转录过程中特异的RNase抑制剂可有效降低由于外源RNase污染而导致实验失败的风险。
通用反转录试剂盒可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。
操作步骤：一、反转录反应1、在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分：1-5μg总RNA或50-500ng mRNA2μL Oligo(dT)或2pmole基因特异性引物16O至14.5μL补RNase-free ddH22、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：4μL5×M-MLV Buffer1μL dNTPs0.5μL RNasin1μL M-MLV3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。
4、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。
5、若用于后续PCR扩增,用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL，取2-5μL作为PCR 反应模板。
注意事项：1、用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。
rt q pcr过程当中要进行五模板对照
rt q pcr过程当中要进行五模板对照
1. 逆转录酶
目前市场上有两种不同的逆转录酶，一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV) ，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H 活性，它最适温度是42 ℃，最适pH 8.3。
但是高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV) 的逆转录酶，是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37 ℃，最适pH 7.6，较弱的RNA酶H活性，可扩增2-3 kb的cDNA。
2. 单价阳离子
离子条件基本上影响各种模板的转录效率。
K +的转录产物⽐Na +较长。
对于cDNA 长度的最适K+浓度为140-150 mM 。
3. 二价阳离子
对于反转录酶活性来说，二价阳离子也是必需的。
产生全长cDNA 产物的最适浓度是6-10 mM。
4.dNTP
四种脱氧核苷三磷酸(dNTP) 的浓度，对于有效合成cDNA是至关重要的。
如果其中只有一种的浓度⽐于10-50 µM，cDNA的产量将明显下降。
常用的dNTP的浓度为200-500 µM 。
5. 引物的选择
逆转录引物一般包含三种：oligo dT，Random Primer Mix和特异性引物。
客户可以根据个人需求进行选择。
RT-PCR实验过程及需要试剂耗材
RT-PCR实验过程及需要试剂耗材RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
试验前注意：1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
试验过程：实验器具：1、 移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、 吸头：1ml、200μl、20μl3、 匀浆管：5ml4、 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、 EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、 试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇7、 量筒：50ml、250ml、500ml8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、 试管架：5ml、1.5ml、20μl10、 盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、 铝制饭盒：4个12、 塑料小饭盒：1个13、 大瓷缸：2个14、 锡泊纸：一卷15、 卷纸：2卷16、 三角烧瓶：带盖，稍大实验器具的处理与准备：1、 塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP 管）。
2、 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）。
3、 匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC试验试剂：1、 DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、 75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）。
RT-PCR试剂盒说明书
RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:0Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD版本号：KR121221TIANScript RT KitTIANScript cDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104产品内容：储存条件：-20℃保存。
产品介绍：TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA 合成第一链cDNA。
与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。
产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。
注意事项：1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。
有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2. RNA样品要避免基因组DNA污染。
3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。
4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5. cDNA产物应置于-20℃保存。
操作步骤：1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA；2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物；2 μl Super Pure dNTPs mM each);补RNase-Free ddH2O定容至μl。
2. 70℃加热5min后迅速在冰上冷却 2 min。
简短离心收集反应液后加入以下各组分：4 μl 5×First-Strand Buffer (含有DTT)；μl RNasin。
反转录及荧光定量步骤
反转录及荧光定量步骤一、反转录（RT）步骤：1.样品处理：首先需要准备待测样品，可以是RNA提取产品、RNA病毒（如HIV）或RNA转录棒。
如果是细胞或组织样品，则需要进行RNA提取。
2.RNA逆转录：将RNA逆转录为cDNA。
在反转录过程中，需要使用反转录酶（如M-MLV逆转录酶）和逆转录的引物（如随机六聚体引物）。
a. 准备反转录反应体系：根据反转录试剂盒的说明书，将逆转录缓冲液、RNase抑制剂、dNTP混合物、随机六聚体引物、反转录酶和样品（RNA）混合。
b.混合均匀：将反应体系温育于适当的温度，使之反应一定时间。
温度和反应时间根据反转录试剂盒的说明进行选择。
c.停止反应：加入逆转录停止溶液或加热灭活反转录酶，停止反应。
3.储存和保存cDNA：反转录反应结束后，将逆转录产生的cDNA储存在低温下，一般可以放在-20℃的冰箱中保存。
注意避光保存。
二、荧光定量PCR步骤：1. primer设计：根据感兴趣的基因序列，设计一对能够放大目标基因片段的引物。
引物的长度应在20-27碱基对之间，GC含量应在40-60%之间。
2. PCR反应准备：根据PCR试剂盒的说明书，准备PCR反应体系。
包括模板DNA（反转录生成的cDNA）、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、PCR缓冲液、Mg2+和水。
3.PCR反应条件：根据PCR试剂盒的说明书，设置合适的PCR反应条件，包括初始变性和循环反应。
a.初始变性：将PCR反应体系加热到94℃，变性DNA模板，使之解开双链。
b. 循环反应：将反应体系温度降低到引物的退火温度，引物会与模板DNA互相结合。
Taq DNA聚合酶会延伸引物，合成新的DNA链。
c.循环反应一般包括三个基本步骤：变性（94℃）、退火（引物的特异温度）和延伸（72℃）。
循环反应次数由所需扩增片段的长度决定。
4.胶电泳分析：将PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳分析，根据DNA片段大小进行分离和检测。
Reverse Transcriptase M-MLV
M: 1 kbp DNA Ladder（TaKaRa Code：D517A） 1 : 1 μl cDNA 溶液扩增结果 2 : 2 μl cDNA 溶液扩增结果 3 : 5 μl cDNA 溶液扩增结果
●使用本制品进行 2 Step Real Time RT-PCR 反应的实验例
本实验以Mouse Liver Total RNA为模板，使用 2 Step Real Time RT-PCR方法，扩增Mouse GAPDH基因。实验时，首先以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应，然后将得到的cDNA 溶液使用EASY Dilution按 10 倍梯度稀释，再将相当于 1 pg～100 ng Total RNA量的cDNA作为模 板，进行Real Time PCR扩增（使用了SYBR® Green I嵌合荧光法），制作标准曲线。具体实验过程如 下：
Buffer 不同。
*2 反转录引物可使用以下三种引物，使用量分别如下：
Random 6mers（100 μM）
0.5 μl（50 pmol）
Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol）
Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）
1．反转录反应 以 Mouse Liver Total RNA 为模板进行反转录反应。
① 按下列组成配制 RT 反应液（反应液请在冰上配制）。
试剂名称 5×ExScriptTM Buffer*1
使用量 2 μl
dNTP Mixture（各10 mM）
0.5 μl
Random 6mers（100 μM）*2
6. 70℃保温 15 分钟后冰上冷却，得到的 cDNA 溶液可直接用于 2nd-Strand cDNA 的合成或者 PCR 扩增等，PCR 扩增时 cDNA 溶液的使用量建议使用 1 μl～5 μl。
RTPCR操作流程及其相关注意事项
RT-PCR一知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.4、引物的设计及其原则：引物的特异性决定PCR反应特异性。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10度。
c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
一步法RT-PCR试剂盒使用说明书
一步法R T-P C R试剂盒使用说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒)(目录号HS0612-2)产品包装保存条件-20℃ 产品简介本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。
PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。
独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。
使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。
北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2. 耐热性及稳定性强。
3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。
4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用方法（注意：1 ng ~ 5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4. 将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。
反应条件：注意：1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
逆转录pcr要点
逆转录pcr要点逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种常用于从RNA样本中合成相应DNA的技术，通常用于研究基因表达和检测RNA病毒。
以下是逆转录PCR的要点：1. 材料准备：- RNA样本：提取纯净、高质量的RNA。
-逆转录酶：常用的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
-引物：设计合适的引物用于逆转录和PCR步骤。
- dNTPs：提供逆转录和PCR反应所需的四种脱氧核苷酸。
-缓冲液：逆转录和PCR反应所需的缓冲液，通常包含适当的盐和pH条件。
2. 逆转录反应：-将RNA样本与逆转录酶、引物和其他逆转录反应成分混合。
-进行逆转录反应，将RNA转录为相应的DNA。
反应条件和温度根据使用的逆转录酶而有所不同。
3. 酶失活：-在逆转录反应完成后，通常需要对逆转录酶进行失活，以避免其影响PCR反应。
4. PCR反应：-将逆转录产物作为PCR的模板，添加PCR引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs。
-进行PCR反应，放大目标DNA片段。
5. PCR产物检测：-使用凝胶电泳或其他相关技术检测PCR产物的大小和纯度。
-如果需要，可以进行测序确认PCR产物的确切序列。
6. 负对照和阳性对照：-包括负对照，使用不含模板的反应混合物，以检测污染或引物二聚体等问题。
-包括阳性对照，使用已知的PCR产物或模板，以验证PCR反应的有效性。
7. 实验控制：-注意实验中的质量控制，避免污染和假阳性的可能性。
-重复实验以确保结果的可重复性。
8. 结果分析：-分析PCR产物的凝胶图谱，确认是否成功扩增目标片段。
-如果需要，使用其他技术验证结果，如实时定量PCR（qPCR）。
以上是逆转录PCR的基本要点，具体的实验条件和步骤可能会根据你的研究目的和样本类型而有所不同。
确保仔细阅读逆转录酶和PCR酶的生产商提供的使用说明书，以获取最佳结果。
M-MLV逆转录酶 说明书
单体的分子量约为73kD，具有RNase H活性，无RNase的污染，可用于5kb以下第一链cDNA的合成。
产品来源：重组E.coli菌株,含有从莫洛尼氏鼠中克隆的莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV，Moloney
Murine Leukemia Virus）逆转录酶基因。
活性定义： 以poly(rA)为模板、oligo (dT) 为引物，在37°C条件下，10分钟内催化掺入1nmol的dTTP
3. 离心数秒使反应液聚集于PCR管底部。
4. 继续向上述反应液中加入以下试剂：
5×RT Buffer
4ul *注：也可以使用相对便宜的化学类试剂RNasafe（TIANGEN）
0.1 M DTT RNasin(40U/ul)*
2ul 代替RNasin，效果相同；由于RNasafe只在高温下起作用，需 1ul 在第一步中70℃保温之前加入，本体系中加入1ul即可。
产品纯度：200U的本酶和1ug的16S，23S rRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳条带不发生变化。 反应缓冲液：[5×RT Buffer] 250 mM Tris-HCl（PH 8.3），15 mM MgCl2，375 mM KCl. 反应条件：
z cDNA第一链的合成（反转录反应）：
1. 在无RNAase污染的PCR管中加入以下试剂，全量12ul：
Beijing Protein Institute (BPI) B-8 Airport Industrial Zone, Beijing, China, 101300
Tel: 86-10-80493132, Fax: 86-10-80485460
Oligo (dT)12-18(1ug/ul) 或随机引物（50-250ng）
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通用RT-PCR试剂盒(M-MLV)
货号：RP1100
规格：25T/50T/100T
保存：-20℃保存，避免反复冻融，复检期为1年。
产品内容：
试剂盒组成25次50次100次
M-MLV(200U/ul)25ul50ul50ul×2
5×M-MLV Buffer100ul200ul400ul
(10uM)50ul100ul200ul Oligo(dT)
16
RNasin(40U/ul)12.5ul25ul50ul
dNTPs(10mM)50ul100ul200ul Taq Polymerase(5U/ul)12.5ul25ul50ul
10×PCR Buffer125ul250ul500ul
O500ul1ml1ml×2 RNase-free ddH
2
说明书1份1份1份
产品简介：
本试剂盒适用于各种RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。
它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。
同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。
操作步骤：
一、反转录反应
1、在冰浴的无RNase的离心管中加入如下反应成分：
1-5ug总RNA或50-500ng mRNA
或2pmole基因特异性引物
2ul Oligo(dT)
16
O至14.5ul
补RNase-free ddH
2
2、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：
4ul5×M-MLV Buffer
1ul dNTPs
0.5ul RNasin
1ul M-MLV
3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。
4、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。
5、用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50ul，取2-5ul进行PCR反应。
二、PCR反应
1、按以下各组分配制50ul PCR反应体系：
10×PCR Buffer5ul
dNTPs1ul
上游引物（用户自备10um）1ul
下游引物（用户自备10um）1ul
RT反应产物2ul
Taq Polymerase0.5ul
O x ul
ddH
2
Total Volume50ul
2、混匀后短暂离心，PCR仪扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果。
注意事项：
1、用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。
有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2、试剂盒的各组分应在-20℃保存，避免反复冻融，有效期12个月。
3、RNA样品要避免反复多次冻融，应使RNA在冰浴中处于融化状态。