RT-PCR 荧光定量理论

RT-PCR反应体系 反应体系： 1 RT-PCR反应体系： 1.1 模板 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外 转录的RNA产物。模板RNA最常见的问题是RNA 降解或混有基因组DNA。 1.2 逆转录酶 1.3 DNA聚合酶 1.4 引物
RT-PCR方法 2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内 完成， 有助于减少污染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行， 首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的 cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。
两个概念： 两个概念： 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，为了便于对所检测样本进行比较， 它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意 位置上，一般这个阈值是以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline）,荧光域值的缺省设置是 315 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真 正的信号。 CT 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数被称为 CT 值
图 1 实时荧光扩增曲线图 荧光扩增曲线可以分成三个阶段： 荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平 台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖， 台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判 断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物 量与起始模板量之间没有线性关系， 量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， 之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
RT-PCR技术原理及数据分析 技术原理及数据分析： 三： RT-PCR技术原理及数据分析： 实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应 中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而 实现对起始模板定量及定性的分析。在实时 荧光定量PCR反应中引入了一种荧光化学物 质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断 累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过 一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我 们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变 化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
3 提高 提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性： 反应的灵敏度与特异性： 反应的灵敏度与特异性 3.1 首先应确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入 RNase抑制剂RNasin。 3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性， 太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好， 可提高逆转录反应温度。 3.6 设计引物时，避免在引物3´端含有互补序列，避 免可以形成内部发卡结构的序列。
荧光探针和荧光染料： 荧光探针和荧光染料： RT-PCR 的化学原理包括探针类和非探针 类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的 探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是 利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩 增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤， 特异性更高，但后者则简便易行。
荧光染料 （ SYBR Green I ）
RT-PCR原理及方法
报告人：樊凤娇
一 、 RT-PCR反应原理与方法 反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产 物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结 合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的平，细胞中RNA病毒 的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。
四：RT-PCR的应用: RT-PCR的应用: 的应用 1 临床、食品及环境应用 主要包括病原微生物检测、病原体检测、 基因病诊断、传染病检测和病变检测等。 2 分子生物学应用 分子生物学上RT-PCR应用相当广泛，包括 基因转录检测（同一基因在不同组织的表 达差异，如药物处理、物理处理、化学处 理等），特定基因在不同时期的表达差异 等。 3 遗传学，SNP分析及深入应用
SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结 合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地 掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会 发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设 计的程序通用性好。
2.3 一步法与两步法区别： 一步法更方便，且可防止在管与管之间 转换过程中污染样品，可适用于大量样品 分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引 物时具有更大的灵活性，同时可由一次反 转录样品获得多个遗传信息。陈阳婷等在 研究一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃 薯病毒诊断研究的比较中得出，两步法RTPCR具有较高的灵敏性，但这两种方法均可 快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。
4： RT-PCR中PGES和PGFS引物以及内参 ： 中 和 引物以及内参 引物 序列
Suranga P Kodithuwakku Spermatozoa stimulate prostaglandin synthesis and secretion in bovine oviductal epithelial cells
荧光探针 （TaqMan 探针 ）
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针， 它的荧光与目的序列的扩增相关。 它设计为与目标序列上游引物和下 游引物之间的序列配对。荧光基团 连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则 在 3’ 末端。当完整的探针与目标序 列配对时，荧光基团发射的荧光基 因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。 但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得 荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增 循环数的增加，释放出来的荧光基 团不断积累。因此荧光强度与扩增 产物的数量呈正比关系。