1一步法荧光定量反转录PCR试剂盒
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
一步法RT-PCR试剂盒使用说明书
一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒)(目录号HS0612-2)产品包装保存条件-20℃产品简介本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。
PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。
独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。
使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。
北京厚生博泰科技有限公司Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2. 耐热性及稳定性强。
3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。
4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用方法1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。
BioRT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明书（一步法）
b、按以下条件进行PCR反应94℃3m i n94℃30s25-35循环***37℃-65℃**30s72℃****45s-7min72℃5min注：*RT产物可增加至5μl 。
**退火温度根据引物Tm值调整，一般为Tm-5℃。
Control引物退火温度为55℃。
*** 当实验样品RNA特别稀少时，可将循环数增加至40-45循环。
**** 延伸时间根据PCR产物大小确定，一般1kb/min 。
Control引物延伸时间45s。
c、反应结束后，取3-5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
RNA control反应时，退火温度55度，30个循环，扩增片段大小为500bp。
使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。
TaqMan One Step RT-qPCR Kit(Probe qRT-PCR)
TaqMan One Step RT-qPCR Kit（Probe qRT-PCR）货号：T2210规格：50T/200T（25μl体系为例）试剂组成：25×One Step RT-qPCR RTase mix5×One Step RT-qPCR Buffer保存：-20℃保存长期保存，使用前应混匀，避免反复冻融。
产品说明：TaqMan One Step RT-qPCR kit（qRT-PCR Probe）是一步法（One Step）RT-PCR荧光定量探针法定性、定量反应的专用试剂，反应过程在同一管内连续进行，避免开管，能有效防止污染。
本品含有高温反转录酶（RNase H-）和新型热启动酶，具有更高的反转录和PCR扩增效率，适合于低浓度RNA模板的高灵敏度扩增。
本试剂采用优化配方的专用Buffer，可以在较宽的定量区域内得到良好的标准曲线，准确进行定量，并与多数厂家的荧光定量PCR仪兼容，如Applied Biosystems、Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。
试剂原理：TaqMan One Step RT-qPCR kit首先利用反转录酶RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板通过热启动DNA扩增酶在单管闭管反应体系中连续进行PCR扩增反应，利用荧光标记探针（Probe）水解发光，并对发光信号进行检测。
1.RT-PCR首先采用反转录酶以RNA为模板合成cDNA，然后再以合成的cDNA为模板，经过PCR扩增反应的热变性、引物退火、链延伸三个步骤循环往复，在短时间内扩增得到大量DNA片段。
2.荧光检出TaqMan探针法是使用5’端带有荧光物质，3’端带有淬灭物质的TaqMan探针进行荧光检测的方法。
在探针没有被Taq酶分解时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。
而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
一步法超级荧光定量PCR实验(探针法)
产品特点 ◎逆转录和定量 PCR 在一个反应管内一步完成，操作简便快速； ◎使用化学修饰的热启动聚合酶，反应特异性高，有效避免了非特异扩增； ◎反应缓冲液经充分优化，灵敏度高，最低可检测 1pg 总 RNA 中的目标片段,特别适合低拷贝 RNA 的检测。 ◎添加了百代生物 RT-PCR 专利活素，可明显提升 RT-PCR 的产量，CT 值一般早 3-5 循环，S 型曲线更加典型。
2xBIOGHSC Super Probe Mix BIOGHSC Super Enzyme Mix RT-PCR Enhancer 上下游引物 (10μM) TaqMan Probe (10μM) 50×ROX Reference Dye 模板 RNA RNase free ddH2O
10μl 0.3μl 0.25μl 各 0.6μl 0.5μl 0.4μl 10ng-1μg 加 20µl
说明：1、BIOGHSC Super Probe Mix 包含 dNTP Mix 和 Mg2+，BIOGHSC Super Enzyme Mix 包含 BIOG 超级逆转录酶和 BIOG 热启动聚合酶、 荧光保护素。2、一般来说反应体系中引物终浓度为 0.3μM 可得到较好的扩增效果。当反应结果不理想时，可以在 0.1-1.0μM 范围内调整引 物浓度。 3、TaqMan 探针终浓度可以在 0.1μM-0.45μM 之间调整。4、qPCR 反应灵敏性高，模板量的准确性对结果影响很大，建议将模板适 度稀释后加入，或用 50µl 反应体系。5、模板体积最好不超过反应体积的 10%。6、扩增产物长度请选择在 100bp-500bp 范围内，最好为 100-200bp。 7、配制反应体系时，避免震荡混匀，以防气泡产生。8、反应条件：先于 42℃逆转录反应 15 分钟，再于 95℃加热 10 分钟，以激活热启动 DNA 聚合酶，然后 95℃ 15 秒，60℃ 35 秒，35-40 个循环。该反应条件可根据目标片段的大小、引物的 Tm 值等适当调整。8、如果模板具 有复杂二级结构，可将反应温度提高至 55℃，有助于提高产量。
荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 [兼容模式]
![荧光定量PCR实验流程及所需试剂耗材介绍 [兼容模式]](https://img.taocdn.com/s3/m/57fe5ef1fab069dc5022019e.png)
2012年5月30日星期三•实验流程：•一、RNA的提取•二、反转录（RT-PCR）•三、荧光定量PCR（qPCR）•四、数据分析•实验注意事项：实验方法：异硫氰酸胍-酚-氯仿（三试剂）单步总RNA提取方法——Trizol法实验所需试剂：推荐BIO-RAD的Aurum TM基于膜总RNA试剂盒或PureZol TM RNA分离试剂Aurum TM总RNA小型试剂盒PureZol TM RNA分离试剂可以从广泛的样本，如培养细胞、细菌、酵母PureZol TM RNA分离试剂操作是Chomczynski 动物和植物组织中，提取无DNA污染的总RNA。
试和Sacchi的快速、广泛使用的有效RNA分离方法基剂盒采用严格配比的含有异硫氰酸胍和巯基乙醇的试础上改进而得。
PureZol TM RNA分离试剂是一种剂，高效裂解样品并快速灭活RNA酶，然后通过离心苯酚和促溶剂异硫氰酸胍的液相混合物，简单的或抽真空对离心柱硅质膜上的RNA进行纯化。
这个试一步法就可以高效地完成细胞和组织溶解、去除剂盒也可以用于RNA净化和脱盐。
RNA蛋白和灭活的内源核酸酶。
DNA和蛋白通过液相分层，有效地与RNA分离。
形式：小柱过滤（抽真空或离心）形式：单一有机溶液分离方法：硅质膜分离方法：有机提取* RNA提取实验结束后，请验证RNA的纯度和完整性：1、OD260/OD280=1.8～2.0，表示RNA质量好，没有蛋白和苯酚的污染。
2、通过琼脂糖凝胶电泳来验证RNA是否降解实验所需试剂：推荐BIO-RAD iScript cDNA Synthesis Kit该试剂盒组成优化好的5×iScript反应混合液Mix除RNA模板以外所需所有成分的反转录酶混合液缓冲液纯化的iScript RNase H加MMLV反转录酶Oligo(dT) 防止RNA模板非选择性降解的RNase抑制剂随机引物dNTP稳定剂和增强剂iScript cDNA 合成试剂盒的特点★试剂中既有oligo(dT)，也有随机引物——保证各种RNA模板均能正常反应★预混的优化好的组分——使操作非常便捷，减少了交叉污染，也减少了操作误差，节约了时间★优化的反应条件，高的反转录效率，宽的RNA模板范围——100fg-1ug★带有高活性的iScript RNaseH+MMLV反转录酶和用于保护RNA模板的RNase抑制剂，满足不同用户需求★Sensitive detection from 1 pg to 1mg of input RNAiScript cDNA Synthesis Kit，BIO-RAD To a 0.2-ml tube add:4 ul 5X cDNA Synthesis System1 ul iScript enzyme mixx ul nuclease-free waterx ul RNA sample20 ul final volume SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR, InvitrogenTo a 0.2-ml tube add:0.5 ul oligo(dT)12-18, 500 mg/ml 0.5 ul Random hexamers, 50 ng/ml 2 ul 10X buffer4 ul 25 mM MgCl21 ul 10 mM dNTP2 ul 0.1M DTT1 ul RNaseOUT (40U/ml)1 ul SuperScript II RT (50 U/ml) x ul DEPC-treated waterx ul RNA sample20 ul final volumeiScript cDNA 合成试剂盒——试剂成分比较iScript cDNA Synthesis Kit5 min at 25o C30 min at 42o C5 min at 85o CHold at 4o CTotal time: 45 minutesWith iScript –just set-up the thermal cycler and walk away!SuperScript II First-Strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen5 min at 65o CQuick chill on iceAdd more itemsMix and incubate for 2 min at 42o CAdd SuperScript enzymeIncubate for 50 min at 42o CHeat kill 15 min at 70o CTotal time: 85 to 90 minutesWith SuperScript, you’re tied to the bench AND you’ll be waiting for your cDNA longer!iScript cDNA 合成试剂盒——Protocol 比较市面上几款反转录试剂对比Poor sensitivity even though its protocol time is only 25min!Bio-Rad Quanta Invitrogen Invitrogen ABI Stratagene Qiagen iScriptqscriptSuperscript III for qPCR VILOHigh-capacity kits Affinity Script QuantitectStep 1 -Priming 25°C –5 min 22°C –5 min 25°C –10 min 25°C –10 min 25°C –10 min 25°C –10 minStep 2 -Incubation42°C –30 min 42°C –30 min 50°C –30 min 42°C –60 min 37°C –120 min 42°C –55°C –60 min 42°C –15 min Step 3 -Denaturation 85°C –5 min85°C –5 min85°C –5 min 85°C –5 min85°C –5 sec70°C –15 min95°C –3 min Step 4 –RnaseH treatment 37°C –20 minStep 5•数据来源：中科院遗传与发育研究所•使用机型：Bio-Rad CFX96•对比产品：Bio-Rad公司iScript cDNA synthesis kit，Invitrogen的superscript III，Promega的GoScript，Roche的Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit•反馈信息：使用者首先对总RNA进行10倍梯度稀释（1ug,100ng,10ng,1ng），再分别使用不同公司的产品做反转录，然后用Bio-Rad CFX96进行定量实验，定量试剂为Bio-Rad公司的SsoFast EvaGreen超混液，目的基因为actin。
非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(一步法)说明书和内包装标签(2022版)
非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）说明书和内包装标签（一）非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）说明书【兽药名称】通用名非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）商品名无英文名African Swine Fever Virus Real - time PCR Test Kit （One - step）汉语拼音Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe （Yibufa）【主要成分与含量】编号试剂盒组分装量用法ASFV01 -qf50缓冲液Bl5ml/瓶直接使用ASFV 02 - qf50缓冲液B25ml/瓶直接使用ASFV 03 - qf50PCR反应液900叱管直接使用ASFV 04 - qf50阳性对照1ml /管直接使用ASFV 05 - qf50阴性对照1ml /管直接使用【作用与用途】用于全血、血清、血浆、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体和肌肉等样品中的非洲猪瘟病毒核酸的检测。
【用法与判定】1用法1.1样品处理1.1.1全血、血清、血浆直接进行下一步试验。
淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肌肉等组织样品取0.1〜0.2g,置研钵充分研磨，加入10倍体积约1〜2ml生理盐水，混匀；或置研磨管中，加入10倍体积约1〜2ml生理盐水及研磨珠，用组织研磨仪匀浆。
以5000转/分钟离心5分钟，留上清，即为组织匀浆液。
1.1.2取1.5ml离心管加入100川缓冲液B1,每管分别加入10可全血（EDTA抗凝剂）或20m组织匀浆液、血清、血浆样品、阳性对照和阴性对照混匀。
室温3分钟内涡旋混匀3〜5次。
1.1.3每管加入100W缓冲液B2,涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为待检核酸。
1.2扩增试剂准备取18WPCR反应液至PCR反应管；依次分别加入2囚阴性对照、样品和阳性对照待检核酸，盖紧管盖，每个反应管内反应体积为20N。
1.3将PCR反应管瞬时离心，置荧光PCR仪内，进行如下反应：1） 95℃预变性20秒；2）95c变性10秒，58c延伸20秒，共40个循环；设置58c收集FAM 荧光信号。
一步法RT-PCR试剂盒
时间
50
30 分钟
95
2 分钟
95
30 秒
Tm 用户设定温度（50－62）
1 分钟
70
1 分钟至 4 分钟（注意事项 9）
70
5 分钟
1． PCR 产物置于－20℃冰箱里保存，直到进行任何后续实验
2． 进行琼脂糖凝胶电泳分析
循环 1 1
35 至 40
1
注意事项
1． 本产品为 20 次操作 2． 整个操作须在 4℃状态下进行 3． 避免反复冻融 4． 整个操作须带手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解 RNA 5． 建议所有的操作用品属于 RNA 专用 6． 根据用户 PCR 仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil） 7． 根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)公式确定 Tm 温度；建议使用分析软件 8． 建议使用完整 RNA 片段，避免基因组 DNA 污染 9． 根据扩增片段的长度，调整 PCR 延长时间 1 分钟至 4 分钟：3kb－2 分钟；6kb－4 分钟 10．本公司提供系列 RT－PCR 产品
逆转录 PCR 一步法（RT－PCR）试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
逆转录PCR一步法（RT－PCR）试剂是一种旨在通过逆转录酶（reverse transcriptase）和Tag 多聚 酶（polymerase）的融合作用直接把RNA逆转录成cDNA后，直接完成扩增，进行分析RNA构造的权威而经典 的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的，融合了世界上最优势的技术元素。其适 用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表达等。尤其可用于低拷贝量的RNA样品。产品即到即用，性能稳定，严格无 核酶污染，操作极为简便，敏感性强，逆转录效率和扩增产量皆高，重复性好。
SYBR一步法荧光定量PCR试剂盒使用说明书
一步法实时RTPCR 检测试剂盒（SYBR 一步法荧光定量PCR 试剂盒）(目录号HS0614)产品包装保存条件-20℃避光保存。
产品简介本产品是一步法Real-Time qRT-PCR 专用试剂盒。
所含的SYBR Green I 荧光染料可以与所有的双链DNA 相结合，使该产品可以用于多种不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。
使用本产品进行Real Time qRT-PCR 反应，逆转录和定量PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。
本试剂盒中包含全新高效逆转录酶，具有与RNA 高亲和性的特点，能通读GC 含量高、二级结构复杂的RNA 模板；所包含的经化学修饰的热启动DNA 聚合酶最大限度的减少PCR 扩增全程中的非特异性扩增产物的产生，极大提高了荧光定量PCR 反应的精确性；所包含的缓冲系统使以上两种酶同时发挥最大的功效，提高效率。
所含的ROX 染料调节PCR 反应过程中管与管之间的加样误差，适用于以ROX 作为校正染料的所有荧光定量PCR 仪。
北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 反转录和PCR在一个反应管中完成，方便快捷，最大限度的避免污染。
2. 与RNA具有高亲和性，能通读GC含量高、二级结构复杂的RNA模板。
3. 热启动酶有效抑制非特异性扩增，极大提高了荧光定量PCR反应的精确性。
产品应用基因表达分析；拷贝数分析。
使用方法1. 将RNA 模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffe（r With ROX）、SuperEnzyme Mix 和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2. PCR 反应体系：•注意：通常引物浓度以0.2 uM可以得到较好结果，可以终浓度0.1 ~ 0.5 uM作为设定范围的参考。
三种荧光定量PCR检测方法比较
三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：<1> SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链DNA 结合后, 荧光大大增强。
因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。
PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。
这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。
<2> 水解探针模式<taq man探针>TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。
当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
因此Taqman 探针检测的是积累荧光。
PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。
THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit 试用品 使用说明书
15-12高效率One-step qRT-PCR KitTHUNDERBIRD®Probe One-step qRT-PCR Kit试用品(Code No. QRZ-101, QRZ-101S)使用说明书TOYOBO CO., LTD. Life Science DepartmentOSAKA JAPAN目录[1] 简介 (1)[2] 产品内容 (2)[3] 除产品以外需要准备的物品 (3)[4] 使用方法 (4)1. 引物及TaqMan® Probe的设计方法与性能确认 (4)2. 反应液的制备 (5)3. 循环条件设定 (6)[5] 各仪器循环条件设定例 (7)1. Applied Biosystems® StepOnePlus TM (7)2. LightCycler® 96 (8)3. CFX96 Touch TM Deep Well (9)[6] 最适反应条件讨论方法 (10)1. 条件讨论的顺序 (10)2. 延伸(退火)温度・时间的讨论方法 (11)3. 引物・TaqMan® Probe浓度的探讨方法 (12)[7] 实验例 (13)实验例1:纯化RNA的检测 (13)实验例2: 多数目的片段的同时检测 (14)[8] Trouble shooting (16)1. PCR效率低、检测灵敏度低、检测结果散乱 (16)2. 定量值的误差 (17)3. 阴性样品中见到信号 (17)[9] 相关产品 (18)注意本试剂盒中含有的试剂均为研究用途。
请勿作为诊断・临床试剂使用。
使用本试剂盒时，请严格遵守实验室的相关注意事项，安全规范操作。
[1] 简介THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit是以高效逆转录酶ReverTra Ace®为逆转录酶与以Tth DNA Polymerase 作为PCR酶的双酶体系进行一步法荧光定量PCR的试剂盒。
荧光定量 PCR 一步法 RT-PCR 使用说明书
荧光定量PCR一步法RT-PCR使用说明书本试剂盒适用于各种动、植物、病毒RNA的荧光定量PCR 检测，反转录PCR反应体系为30µl，用户在使用此试剂盒之前请详细阅读此说明书。
本试剂盒主要有两个部分组成：RT-PCR MIX 和2×反应缓冲液。
RT-PCR MIX由反转录酶和Taq DNA聚合酶组成的混合酶，既可cDNA合成又可PCR扩增。
2×反应缓冲液对其主要成分Mg2+、dNTPs及稳定剂都已经优化，直接用于荧光定量PCR的检测，用户只需加入引物探针和一定的模板即可，适用各种荧光定量PCR仪如：lightcycler、ABI7000、icycler等。
（本试剂盒不适合做sybr green染料法）编号：ZK00101规格：10次试剂盒组成：名称浓度体积2×反应缓冲液300µlRT-PCR MIX20µl实验操作:1．取103-106拷贝的特异目的模板或1pg-1µg的总RNA或1-10ng纯化的mRNA于一支0.2或0.5ml离心管中，65-70℃保温5-10分钟，离心数秒，放置冰浴中。
（此步骤是为了变性RNA，建议保留）2．反应体系的配制：组分体积终浓度2× 反应缓冲液15µl 1×下游引物*(25pmol/ul) 1ul 0.5-1µM上游引物*(25pmol/ul) 1ul 0.5-1µM荧光探针*(25pmol/ul)0.3ull 0.2-0.5uMRT-PCR MIX2µlRNA样品或对照** YµlDEPC-ddH2O（加至终体积为30µl）Xµl终体积30µl按照指定的体积将DEPC-ddH2O、2x 反应缓冲液、RT-PCR MIX、特异上下游引物探针加入到置于冰上的0.2ml薄壁反应管中，配制成反应混合物，将反应管轻柔震荡10秒以使该混合物混匀。
反转录试剂盒说明书
行业文档TaKaRa Code：DRR014APrimeScript™ RT-PCR Kit(50次量)目录内容页码●制品说明 1●制品内容 1●保 存 2●原 理 2●试剂盒特点 3●RNA样品制备 3●使用注意 4●反转录引物的选择 5●实验操作 5●实验例 7 ●Q&A8●制品说明PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。
虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。
迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
PrimeScript™ RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。
反转录反应使用了TaKaRa独自开发的新型反转录酶PrimeScript™ RTase；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq TM HS。
本试剂盒具有以下优点：1.进行高效的RT-PCR扩增。
2.在标准的RNA反转录反应温度（42℃）下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，可以避免RNA在高温条件下的降解。
3.能有效抑制非特异性的PCR扩增。
4.使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个A碱基，可以直接克隆于T-Vector中。
本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。
●制品内容（50次量*1）1.PrimeScript™ RTase（for 2 Step）2.5×PrimeScript™ Buffer3.RNase Inhibitor（40 U/μl）4.dNTP Mixture（10 mM each）5.Oligo dT Primer（2.5 μM）6.Random 6 mers（20 μM）7.TaKaRa Ex Taq TM HS（5 U/μl）8.10×PCR BufferⅡ9.Control F-1 Primer*2（20 μM）10.Control R-1 Primer*3（20 μM）11.Positive Control RNA（2×105 copies/μl）12. RNase Free dH2O25 μl 200 μl 25 μl 150 μl 50 μl 50 μl 25 μl 250 μl 10 μl 10 μl 20 μl 1 ml*1 反转录反应20 μl 、PCR反应50 μl体系时可使用50次。
反转录及荧光定量步骤
反转录及荧光定量步骤一、反转录（RT）步骤：1.样品处理：首先需要准备待测样品，可以是RNA提取产品、RNA病毒（如HIV）或RNA转录棒。
如果是细胞或组织样品，则需要进行RNA提取。
2.RNA逆转录：将RNA逆转录为cDNA。
在反转录过程中，需要使用反转录酶（如M-MLV逆转录酶）和逆转录的引物（如随机六聚体引物）。
a. 准备反转录反应体系：根据反转录试剂盒的说明书，将逆转录缓冲液、RNase抑制剂、dNTP混合物、随机六聚体引物、反转录酶和样品（RNA）混合。
b.混合均匀：将反应体系温育于适当的温度，使之反应一定时间。
温度和反应时间根据反转录试剂盒的说明进行选择。
c.停止反应：加入逆转录停止溶液或加热灭活反转录酶，停止反应。
3.储存和保存cDNA：反转录反应结束后，将逆转录产生的cDNA储存在低温下，一般可以放在-20℃的冰箱中保存。
注意避光保存。
二、荧光定量PCR步骤：1. primer设计：根据感兴趣的基因序列，设计一对能够放大目标基因片段的引物。
引物的长度应在20-27碱基对之间，GC含量应在40-60%之间。
2. PCR反应准备：根据PCR试剂盒的说明书，准备PCR反应体系。
包括模板DNA（反转录生成的cDNA）、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、PCR缓冲液、Mg2+和水。
3.PCR反应条件：根据PCR试剂盒的说明书，设置合适的PCR反应条件，包括初始变性和循环反应。
a.初始变性：将PCR反应体系加热到94℃，变性DNA模板，使之解开双链。
b. 循环反应：将反应体系温度降低到引物的退火温度，引物会与模板DNA互相结合。
Taq DNA聚合酶会延伸引物，合成新的DNA链。
c.循环反应一般包括三个基本步骤：变性（94℃）、退火（引物的特异温度）和延伸（72℃）。
循环反应次数由所需扩增片段的长度决定。
4.胶电泳分析：将PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳分析，根据DNA片段大小进行分离和检测。
StarScriptIIProbeFastOne-StepqRT-PCRKit一步法反转录实时
StarScript II Probe Fast One-Step qRT-PCR Kit 一步法反转录实时荧光定量快速检测试剂盒—探针法【产品概述】StarScript II Probe One-step qRT-PCR Kit 是采用探针法进行一步法实时荧光定量检测的专用试剂盒。
使用本制品进行Real Time RT-PCR 反应时以提取的RNA 为模版，在同一反应管内连续进行反转录和荧光定量检测，操作简单，并能有效防止污染、降低加样误差。
本产品基于高效的StarScript II 反转录酶、抗体型Hotstart Taq DNA 聚合酶配合优化的Buffer 体系研制，在提高检测灵敏度的同时保证了扩增的特异性；非常适合于RNA 病毒等微量目标基因的检测。
本产品为2×预混型荧光定量PCR 反应体系，使用时只需加入模板、引物、ROX Reference Dye （用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，根据不同荧光定量PCR 仪选择使用）和水，使其工作浓度为1×，即可进行反应。
具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度地减少人为误差、节约PCR 实验操作时间、降低污染几率。
【产品组分】组分名称A324-试用 A324-01 A324-05 A324-10 StarScript II One-Step Enzyme Mix 22ul 220ul 1.1 ml*1 2.2 ml*1 2×StarScript II Probe One-Step qRT-PCR Buffer110ul 1.1 ml 1.1 ml*5 3.67 ml*3 DEPC-ddH 2O110ul1.1 ml1.1 ml*53.67 ml*3*注：不同仪器所需ROX Reference Dye 不同，如需添加，需致电单独配带：ROX Reference Dye (50×):ABI Prism7000/7300/7700/7900HT 和ABI Step One /ABI Step One Plus 。
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注意事项：
●当同时需要进行数次Real Time One Step qRT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（M aster M ix；其中 包括RNase-free ddH2O、Buffer、各种酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确， 减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。 ●使用Enzyme M ix和TRUEscript RTase时，分取之前要小心地瞬间离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含 有高浓度的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。 ●2×qRT-PCR M ix内含Sybr Green I，保存或配制One Step qRT-PCR反应液时应避免强光照射。 ●为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。 ●不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。 ●只能使用特异性引物，不能使用 Oligo(dT) 和 Random Primer 进行反应。
TUREscript One Step qRT-PCR Kit
包 装 量：
目录编号 154101 154102
包装单位 25次 50次
使用说明书
组成
2×qRT-PCR M ix(Contains Sybr Green) Enzyme M ix (Contains HotM aster DNA Polymerase and RNasin) TRUEscript RTase
反应体系（50 μl）：
注意：2×qRT-PCR Buffer 低温时可能有结晶析出，应手心加热或者涡旋振荡恢复融解后使用。短期使用可放 4℃ 冰箱。
根据下表冰上配制反应液：
Comp onent s
Volumn
Final Concentration
2×qRT-PCR M ix Forward Primer（10μm） Reverse Primer（10μm）
少非特异扩增，增强 扩增的特异性。
3. 实验结果分析。反应结束后确认 One Step qRT-PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 RT-PCR 定量时制作标准 曲线等。
NOT FOR HUMAN OR DRUG USE
RNase free H2O
154101 625μl 25 μl 25 μl 1.5 ml
154102 1250 μl 50 μl 50 μl 1.5 ml
产品组成、储存、 浓度：
储存：－20℃ 保存，有效期 6 个月。
制品说明：本制品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂，用本制品进行 Real Time
25 μl 1 μl 1 μl
1×0.2 μM 0.2μM
Enzyme M ix
1 μl
-
TRUEscript RTase
1 μl
-RNA templateX μl1p g-2μg-
RNase free H2O
To X μl
Not applicable -
注意：引物浓度请以终浓度 0.2-0.6μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发
生非特 异性反应时， 可降低引物浓度 ，由此优化反应 体系。如果同 进行多个反应， 先按比例配成 混合液，振
荡混匀后，按每管 50-Xμl (X 为模板量)分装。
Real Time PCR 扩增：
1. 将配制好的反应体系混匀、离心后。 2. 将 PCR 仪器预热到 42℃，将 PCR 管置于荧光定量 PCR 热循环仪中，按以下反应条件进行反应。 扩增程序：
温度
时间
循环数
1
42℃
30 分钟
1
2
94℃
2-3 分钟
1
94℃
20 秒
3
50-60℃
20 秒
30-40
68℃
20 秒
4
根据需要加入融链曲线分析
注意：如果所采用的荧光定量 PCR 仪器没有特殊的要求，建议采用上述图表显示的标准的三步法 PCR 反应
程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行 PCR 条件的优化，例如采用两步法进行扩增可以减
qRT-PCR 可在同一反应管内连续进行。反应过程中无需打开管盖添加试剂并可对扩增产物进行 实时检测，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。非常适合于微量 RNA 的检测。本 试剂盒包括最适合 Real Time PCR 的突变改造 M -M uLV H M inus 逆转录酶、热启动 HotM aster Taq DNA 聚合酶和 RNasin 抑制剂 mix、同时包含适用于逆转录和 PCR 扩增的优化独特反应体系。本 酶 M-MuLV(RNase Hˉ)的 RNase H 活性缺失，与 M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性。 同时该酶提高了耐热性，可以在 42-50℃反转录，提高了复杂二级结构，GC 含量丰富模板反转录 效率。而采用优质热启动酶 Hotmaster Taq DNA Polymerase 可以最大限度的减少 PCR 扩增全程中 的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量 PCR 反应的精确性。本制品可以在宽广的定量 区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。