细菌的耐药性及检测

细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法

近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如MRSA、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及β内酰胺酶中的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属β内酰胺酶等。临床抗生素的选择使用非常困难。因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测，对患者选择个体化的治疗方案；同时通过耐药检测及流行病学调查，为医院感染控制方案制订提供依据；也有助于新药的抗菌特性研究。临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。

(一)药敏试验中抗菌药物的选择原则

抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依据各医院院内感染控制委员会、临床医师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条件：

1.选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某类菌株具有特定的意义等。

2.有助于指导临床抗感染治疗与流行病学的调查。

3.应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的抗菌药物进行体外药敏试验等。

4.根据细菌种类或来源，通常选择6～16种不同抗菌药物。

(二)选择方案

在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组选择。结合本院实际情况制定选用方案。

1.肠杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦或阿奠西林／克拉维酸或哌拉西林／他唑巴坦或替卡西林／克拉维酸中任一种；头孢唑林或头孢噻吩、头孢呋辛或头孢孟多、头孢西丁或头孢替坦、头孢噻肟或头孢他啶或头孢曲松或头孢哌酮中任选二种；头孢吡肟或头孢匹罗；庆大霉素；环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选1～2种；亚胺培南，复方新诺明。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：呋喃妥因、氯霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。

(3)从肠道标本中分离的沙门菌属与志贺菌属细菌常规只应试验和报告氨苄西林、复方新诺明及一种喹诺酮类抗菌药物；分离自肠道以外的沙门菌属菌株应试验和报告多种抗菌药物的药敏试验与报告，包括氯霉素和三代头孢菌素。

(4)分离自脑脊液的肠杆菌科细菌，只需报告氨苄西林、头孢噻吩、头孢唑啉、庆大霉素的药敏结果。

(5)采用合适的方法如双纸片法等检测ESBLs；对产ES-BLs细菌，不管实际药敏检测结果如何，所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南的试验结果报告耐药。

2.铜绿假单胞菌和不动杆菌属等药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一种，头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南或美洛培南；庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素；环丙沙星等。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：羧苄西林、头孢噻肟或头孢曲松、奈替米星、氯霉素、四环素、左氧氟沙星或诺氟沙星或氧氟沙星、复方新诺明等。

(3)除铜绿假单胞菌和不动杆菌可用纸片扩散法进行药敏试验，对其他非发酵菌应使用稀释法进行药敏试验。

3.葡萄球菌属菌种药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G、苯唑西林、头孢噻吩或头孢唑啉；红霉素或克拉霉素或阿齐霉素、克林霉素；万古霉素；复方新诺明。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：氯霉素、环丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星、庆大霉素、四环素、利福平、呋哺妥因等。

(3)青霉素G敏感的葡萄球菌对其他青霉素类、头孢菌素药物敏感；青霉素G耐药，苯唑西林敏感菌株，对β内酰胺酶不稳定的青霉素类耐药，对β内酰胺酶稳定的青霉素类、β内酰胺酶抑制剂复合制剂及头孢菌素类抗菌药物敏感；苯唑西林耐药的葡萄球菌对所有β内酰胺类抗菌药物耐药。因此只要从青霉素G及苯唑西林药敏试验结果，即可推断β内酰胺类抗菌药物的敏感性，不必对这类抗菌药物进行常规药敏试验。

(4)腐生葡萄球菌对苯唑西林的耐药表现不稳定，不能进行以上推导，应以每种抗菌药物稀释法实际检测结果判定。

4.肠球菌属药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G或氨苄西林、万古霉素。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：庆大霉素500、链霉素2000、氯霉素、红霉素、四环素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因等。由于肠球菌天然对氨基糖苷类存在低度耐药，因此在测定时必须使用高浓度药物测定，测定结果仅预示能否用常规剂量进行治疗。

(3)在体外检测肠球菌对头孢菌素娄、氨基糖苷类(除高水平耐药筛选外)、克林霉素、复方新诺明可出现敏感，但临床治疗无效，应报告耐药。

(4)不产β内酰胺酶、青霉素G敏感的肠球菌，可预示氨苄西林、阿莫西林、氨苄西林／舒巴坦、阿莫西林／克拉维酸、哌拉西林／他唑巴坦敏感。来自血液、脑脊液的菌株应检测β内酰胺酶。对严重肠球菌感染，如心内膜炎患者通常用青霉素或氨苄西林或用万古霉素加一种氨基糖苷类药物联合治疗。

(5)耐万古霉素肠球菌(VRE)可选用氯霉素、红霉素、四环素、利福平等抗菌药物作药敏试验，或与感染科医师、临床药学帅等共同商定，并将检测结果报告临床。

5.除肺炎链球菌外其他链球菌属菌药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G或氨苄西林、红霉素、氯霉素、林可霉素、万古霉素等。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：头孢噻肟或头孢曲松、头孢吡肟、左氧氟沙星、氧氟沙星等。

(3)血液和正常无菌部位的体液分离到草绿色链球菌，应检测青霉素G的最低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)。

(4)从尿道分离到的此类细菌，不做红霉素、氯霉素和克林霉素的常规药敏报告。

(5)不需常规进行对用于治疗A群、B群链球菌的青霉素及其他β内酰胺类抗菌药物的敏感试验。发现万古霉素耐药或中介的A群、β群链球菌菌株，应送参考实验室予以确认。

(三)体外抗菌药物敏感试验常用的检测方法

目前可用于细菌药敏检测的方法较多，常用的有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、E-test法和自动化仪器法等。根据实验室条件和需要选用不同方法。

1.稀释法有肉汤稀释法和琼脂稀释法。适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌属和肠球菌属；嗜血杆菌属、奈瑟菌属、肺炎链球菌及其他链球菌等菌株，还适用于厌氧菌、酵母样真菌及支原体等。操作步骤如下：

(1)抗菌药物的稀释：根据每种药物、细菌种类和感染部位的不同，选择不同的抗生素浓度稀释范围，用阳离子调节的M-H肉汤以2n进行倍比稀释抗菌药物(如256、128、64、～0.125……)。将稀释后的药物加人试验管，或加入冷却至45～55℃M-H琼脂培养基中，立即

按无菌要求倾注至无菌平皿。

(2)菌液配制：用无菌生理盐水或M-H肉汤配制成0.5麦氏单位浊度的菌悬液。

(3)接种：在配制好的含药浓度梯度肉汤管中加入上述菌悬液，使其终浓度为105cfu／ml；如果用琼脂稀释法则调节菌悬液为浊度104cfu／ml，采用点种方式接种。

(4)结果观察：

1)最低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration.MIC)的判读：①肉汤稀释法：抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。按受试菌的生长条件，将上述接种好的试验管或平板置35℃及适当的环境中培养16～24小时后观察结果。肉眼观察无细菌生长试验管的最低药物浓度，为该抗菌药物的MIC。②琼脂稀释法：无菌生长的含药平板的最低药物浓度为MIC。一般比肉汤稀释法高1个稀释度。

2)最低杀菌浓度(Minimalbactericidalconcentration.MBC)的判读：MBC表示抗菌药物杀灭99.9％或以上受试菌所需的最低浓度。将高于MIC1～3个稀释度的培养液转种于相应的平板上，在合适条件下35℃培养18～24小时，杀灭99.9％或以上受试菌所需的最低浓度为最低杀菌浓度(MBC)。

(5)结果报告：根据测定的MlC值，与相应抗生素的平均血药浓度或组织浓度比较。如MIC值：血药浓度≤23，则报告敏感；MIC值≥血药浓度则报告耐药；两者之间为中介。

2.纸片扩散法(K-B法)适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌和肠球菌；进行改良后可用于苛养菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌及其他链球菌等的检测。操作步骤如下：

(1)培养基：M-H琼脂培养基。厚度为4mm，pH7.2～7.4。

(2)培养物制备：①直接菌悬液法：取纯培养物直接悬浮于无菌盐水或M-H肉汤培养基，调节悬液浊度至0.5麦氏单位(1.5×108cfu／mL)；②肉汤增菌法：取纯培养物接种M-H肉汤，35℃培养4～6小时，使浊度达到0.5麦氏单位，可用无菌生理盐水或M-H肉汤调节。

(3)接种：用无菌棉签浸入上述菌悬液中，取出时将多余的菌悬液在管壁上挤出，均匀涂布整个平板表面，置室温3～5分钟。

(4)贴药敏纸片：用无菌镊子或分配器将根据要求选定的含药纸片贴于平板表面，使纸片完全与培养基表面接触，每两个纸片间的中心距离不少于24mm。通常直径为90mm的平板可贴4～7张纸片。置35℃孵育16～24小时。

(5)抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显菌苔生长的边缘为界，用最小量度为mm的卡尺量取抑菌环直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可忽略不计。复方新诺明抑菌环内会有轻微细菌生长，小于20％左右可忽略不计。

(6)结果报告：根据每种细菌和每种药物之间的MIC和抑菌环直径之间的相关关系，抑菌环直径的大小可以反应MIC值的高低。因此根据抑菌环直径的大小可以参照稀释法MIC 值的判断标准报告敏感、耐药和中介。每种细菌和每种药物之间判断标准范围可以参考美国CLSI解释标准。

3.体外抗菌药物联合敏感试验通常单种细菌的感染用一种抗生素可以控制。但在以下一些情况需要联合使用抗生素：严重感染(如急性心内膜炎、败血症、腹腔脓肿及脑脓肿等)；病原菌不明确或单一药物疗效不佳；由多重耐药菌株引起的全身感染；中枢神经系统等感染部位药物不易渗八；长期用药可能产生耐药性的感染疾病，如结核病和慢性骨髓炎等；混合感染。此时需要进行抗菌药物的联合敏感试验。

抗菌药物联合试验的结果将出现以下的结果：①协同作用：表示两种药物药效可大干单个药物使用的总和；②累加作用：表示两种药物联合应用后药效等于两个药物各自单独使用时的总和；③无关作用：表示两种药物联合应用的药效等于活性最大的药物的药效；④拮抗作用：表示两种药物联合应用的药效小于奠中活性最大的药物的药效。

根据抗菌药物作用机制可分为杀菌剂和抑菌剂，按其作用的速度又可分为快效和慢效，将不同作用机制的药物联合使用会产生不同的抗菌效果。①杀菌剂之间联合使用可增强抗菌作用或延迟耐药性出现，并可减少单一用药剂量，降低不良反应，是临床最常用的方法。如β内酰胺类与氨基糖苷类药物的联合；多粘菌素与β内酰胺类或氨基糖苷类的联合；②快效杀菌剂与快效抑菌剂的联合用药常可导致相互拮抗作用，如β内酰胺类药物与四环素类抗菌药物，大环内酯类与林可霉素类或氯氨苯醇类抗菌药物的联用等；③慢效杀菌剂和快效抑菌剂联合用药可起到累加或协同的作用，如多粘菌素或氨基糖苷类药物与四环素或大环内酯类或林可霉素的联合应用；④快效杀菌剂和慢效抑菌剂联用往往无增效作用，如β内酰胺类抗菌药物和磺胺药物的联用。

联合药敏试验的方法有：

(1)纸片扩散法联合药敏试验：选择2种相关药物纸片贴于已涂布受试菌的药敏平板，2纸片中心间距为24mm左右。35℃孵育18～24小时后读取结果。

(2)重叠纸片法：将选定的含药纸片分别作单个和2种纸片重叠扩散药敏试验，比较各自的抑菌环直径，判断二种药物是协同或拮抗作用。

(3)棋盘滴定法：又称方阵测试联合效果法。将2种药物以不同比例混合，对受试菌测定MIC。比较2种药混合后的MIC与单独药物MIC值，并通过计算抑菌浓度指数(FIC)来判断2种药是否具有协同或拮抗作用。

(四)苛养菌的药敏试验

苛养菌是指一类需要特殊营养成分才能生长繁殖的细菌，如淋病奈瑟菌、嗜血杆菌及肺炎链球菌等。

1.淋病奈瑟菌的药敏试验可采用纸片扩散法和稀释法进行。但需在含1％添加剂的淋病奈瑟菌GC平板上进行。操作方法同纸片扩散法和稀释法。在35℃5％CO2孵育20～24

小时后测量抑菌环直径。

可选用头孢克肟、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢曲松等抗生素中的1～2种，头孢西丁、头孢呋辛、头孢替坦、环丙沙星或氧氟沙星、青霉素G、壮观霉素、四环素等进行测定。对于分离的菌株可测定β内酰胺酶，阳性结果预示青霉素G等耐药。

2.嗜血杆菌属的药敏试验以下抗菌药物：阿奠西林／克拉维酸、头孢克洛、头孢丙烯、氯碳头孢、头孢地尼、头孢克肟、头孢泊肟、口服头孢呋辛酯、阿奇霉素和克拉霉素等对单一嗜血杆菌感染患者的治疗往往不需进行敏感试验，仅在耐药性监测或流行病学调查时才进行。从脑膜炎、败血症、会厌炎和面部蜂窝炎等重危患者的血液和脑脊液中分离到的流感嗜血杆菌，应进行常规试验并报告氨苄西林、一种三代头孢菌素、氯霉素和美洛培南的药敏结果。氨苄西林敏感试验测定的结果，可预报阿莫西林的活性；大多数耐氨苄西林和阿奠西林的流感嗜血杆菌分离株产生TEM型β内酰胺酶。从细菌性脑膜炎及败血症患者标本中分离的嗜血杆菌，应直接作β内酰胺酶试验，阻快速检出氨苄西林和阿莫西林耐药菌株。

可用纸片扩散法和稀释法进行药敏试验。纸片扩散法使用嗜血杆菌专用HTM培养基，操作同纸片扩散法。接种物制备按直接菌悬液法。稀释法用HTM肉汤。可在常规条件下孵育20～24小时报告，而不一定在5％CO2的环境下。

3.肺炎链球菌的药敏试验在M-H琼脂中添加5％绵羊血，倾注平板用于肺炎链球菌的纸片扩散法试验，接种后置5％CO2、35℃孵育20～24小时观察结果，其他操作同纸片扩散法。大多数抗菌药物需要用含2％～5％(v／v)溶解马血的阳离子调节的M-H肉汤(AMHB-LHB)作为基质，稀释抗菌药物，进行稀释法测定。

肺炎链球菌药敏试验抗菌药物选择方案：

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G(或苯唑西林)、红霉素，四环素，复方新诺明、氧氟沙星或左氧氟沙星或司帕沙星，万古霉素。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：氯霉素，利福平。

(3)可用阿莫西林、氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松、头孢呋辛、亚胺培南和美洛培南治疗肺炎链球菌感染，但体外敏感性应用稀释法测定。

(4)从危重患者(如脑膜炎、败血症)的血液和脑脊液中分离到肺炎链球菌，常规应用稀释法测定青霉素G、头孢噻肟、头孢曲松和亚胺培南的MIC。其他标本的培养物可用苯唑西林筛选试验，若苯唑西林抑菌环<19mm，应测青霉素G、头孢噻肟和头孢曲松的MIC。氧氟沙星敏感的肺炎链球菌，左氧氟沙星也敏感；利福平不能单独用于治疗。

(五)其他细菌药敏试验

1.李斯特菌属肉汤稀释法测定。用含2％～5％(v／v)溶解马血的经阳离子调节的M-H 肉汤(AMHB-LHB)作为基质，稀释抗菌药物，接种后35℃培养16～20小时读取结果。氨苄西林≤2μg／ml、青霉素G≤2μg／ml为敏感。本菌对头孢菌素类抗生素药敏试验结果往往敏感，而临床实际疗效不佳，均应报告耐药。

2.幽门螺杆菌使用琼脂稀释法。用含5％(v／v)溶解绵羊血的M-H琼脂作为基质稀释抗菌药物。取72小时幽门螺杆菌培养物，用生理盐水配成2.0麦氏浊度单位菌悬液。在每种抗菌药物平板上滴加菌悬液接种，35℃微需氧环境下培养3天后观察结果。

3.支原体与细菌L型一般用稀释法测定支原体体外抗菌药物敏感试验。细菌L型应诱导其回复后，对原菌进行检测。

4.结核分枝杆菌的药敏试验由于多重耐药结核分枝杆菌(MDR-TB)的出现，给结核病的治疗带来了困难；加之其生长缓慢，营养要求高，体外药敏试验困难。常用琼脂稀释法制

备含不同浓度梯度抗结核药物的L-J培养基。将受试菌悬液或标本接种至含药培养基中，置35℃需氧培养4周后，观察生长情况。以抗结核药物能抑制结核分枝杆菌生长的最低浓度为MIC。根据不同抗结核药物的最高血药浓度与MIC值进行比较，获得敏感性结果解释。

其他方法有仪器法、E-test法测定等，也可用分子生物学技术如PCR或DNA探针检测结核分枝杆菌的耐药基因。

5.厌氧菌的药敏试验参照CLSI推荐的常量肉汤稀释法、微量肉汤稀释法和琼脂稀释法；也可选用E-test法。肉汤稀释法操作过程基本与需氧菌相同，最好在厌氧手套箱中完成。琼脂稀释法：取一定量纯菌落接种于布氏肉汤或硫乙醇酸钠肉汤。调节菌浓度达0.5麦氏单位。根据不同药物配制抗菌药物T作溶液，与融化并冷至55℃布氏琼脂或GAM琼脂混合倾注灭菌平皿。用多点接种器接种于含药平板，立即置35℃，厌氧培养48～96小时后判定MIC；

②E-test方法：根据细菌生长情况取厌氧血琼脂平板上单个菌落制备菌悬液，并调节浓度至

0.5麦氏单位。用拭子充分蘸取菌悬液，涂布整个琼脂表面。贴上E-test试条，置厌氧环境35℃培养24～48小时观察结果。