第7章细菌耐药性检测

Ⅰ
细胞质
Ⅱ Ⅲ
染色体 细胞壁
第一节 临床常用抗菌药物
一、抗细菌药物 二、 抗厌氧菌药物

第二节 体外抗菌药物敏感试验
一 .药敏试验的抗菌药物选择（NCCLS） 二．K-B纸片琼脂扩散法 三．稀释法 四．E 试验 五、联合药物敏感试验和杀菌试验

第三节 细菌耐药性与产生机制
一、细菌耐药性定义 二、细菌耐药性的产生机制

细菌耐药性的生物化学机制
药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变 对磺胺-甲氧嘧啶耐 药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β-内酰胺类抗生素不能结合或亲和力降 低，则产生耐药，如金黄色葡萄球菌中PBP转变为 PBP2a。大肠埃希菌中PBP3改变，引起对头孢氨苄和 其他头孢抗生素耐药 。 6.肠球菌van基因编码产生肽聚糖上一种前体蛋白，阻碍 万古霉素和肽链间相互作用而导致耐药。
碳青霉烯类，第4代头孢 菌素，大环内酯类， 林可霉素，万古霉素
介于二者之间
AST 结果的解释和报告（续）
三要素 相关性 预测性 药物、机体、病原菌 体外和体内，抑菌和杀菌，单独和联合 耐药表型(个体)→耐药机制→耐药表型(同类) (预测药物) (同类药物)
重点监测的耐药菌株：MRS, PRP, VRE, ESBL 发出有选择、有解释的报告，与医师直接对话
.
青霉素溶解其附近的葡萄球菌菌落
抗菌药物发现史 上几个重要的里程碑

1932年，德国药物学家Domagk发现百浪多 息—第一个磺胺类药物，使现代医学进入 化疗新时代。 1942年，美国科学家Waksman发现链霉素， 奠定了从微生物代谢产物中寻找抗生素的 基础，造就了抗生素发展的黄金时代。

抗菌药物发现史 上几个重要的里程碑
– （一）NCCLS关于临床实验室进行结核分枝
杆菌体外抗菌药物敏感试验的指征 – （二）体外药敏试验抗分枝杆菌药物的选择 – (三) 结核分枝杆菌体外药敏试验方法 – 比例法，绝对浓度法和耐药率法
第六节 抗菌药物治疗效果观察

一、
临床效果
– （一）患者临床症状与体征 – （二）患者实验室检查

二、

从左到右依次为常见菌、苛养菌、厌氧菌、酵母菌和其他霉菌的 E 试验结果
联合药物敏感试验意义 联合抑菌试验 最低杀菌浓度测定

左起第四管为药物最低浓度而肉眼无细菌生长，即待测菌的 MIC 为 16mg/L
抗菌药物是指具
有杀菌或抑菌活 性的抗生素和化 学合成药物。
抗菌素抑菌杀菌作用

β-内酰胺酶的分类及特征
结构分类 功能分类 名称 来源 (Ambler) ( Bush) 丝氨酸-Lam C 1 头孢菌素酶 染色体 A 2a 青霉素酶 质粒 2b 广谱酶 质粒 2be 超广谱酶（ESBLs） 质粒 2∽6 2br 耐酶抑制剂广谱酶(IRTs) 质粒 2c 羧苄酶 质粒 2e 头孢菌素酶 染色体 2f 非金属碳青霉烯酶 染色体 D 2d 氯唑西林酶 质粒 4 青霉素酶 染色体 Zinc-Lam B 3 金属酶 染色体 代表酶 AmpC PC1 TEM-1，2 、 SHV-1 TEM-3∽29, SHVTEM30-41,TRC-1 PSE-1、 CARB-3 Cxase IMI-1,NMC-A、Sme-1 OXA-1,PSE-2
细菌学效果
– （一）病原菌清除的测定
– （二）细菌耐药性
The end Thank you
（一）β -内酰胺类
1. 青霉素类 2. 头孢菌素类 3. 单环类 4.头霉素类 5. 碳青霉烯类 6.β -内酰胺类/β -内酰胺酶抑制剂

（二）糖肽类 （三）氯霉素 （四）氨基糖苷类 （五）大环内酯类 （六）四环素类 （七）氟喹诺酮类 （八）磺胺类
AST
方法
（1）手工试验 1.纸片扩散法（S，I，R） 2.稀释法（MIC） 3.E test（MIC） Vitek，Microscan， Phoenix PCR直接检测mecA基因 Nitrocefin、ESBL检测
（2）自动仪器
（3）分子试验 （4）酶试验
AST


结果的解释和报告
R I S MIC
缩短投药间隔， 尽量延长血药浓度 超过MIC的时间 提高血药浓度， 延长投药间隔时间
时间依赖性 β-内酰胺类 （杀菌作用与血药浓度 青霉素类、第1、2、3代 关系不大，无PAE或很短） 头孢菌素类和氨曲南 浓度依赖性 （杀菌作用与血药峰浓度 有关系，有较好PAE） 介于二者之间 （杀菌作用非浓度依赖， 有一定PAE） 氨基糖苷类 喹诺酮类
时间依赖性：β-内酰胺类，缩短投药间隔
（time above MIC %） =血药浓度高于MIC90的维持时间（h） /给药间隔时间（h）
time＞MIC=40~50%
60~70%

good
very good
浓度依赖性：氨基糖苷类，日剂量1次应用
时间与浓度依赖抗生素的区分
特点与分类 代表药物 建议投药方法

1959年，英国科学家Chain利用大肠杆菌酰 胺酶，从青霉素制备中间体6APA获得成功， 开创了半合成抗生素的新时代。 1973年，应用超敏感菌筛选模型获得β-内酰 胺酶抑制剂，有效地控制了耐药菌引起的 感染。

不同抗菌药物的三种作用模式
类型 抗菌模式 抑菌 源自文库bacteriostatic） 杀菌 （bactericidal） 溶菌 （bacteriolytic） 作用靶位 作用机制 可逆性抑制： 1) 转录 2) 转译 3)细胞代谢 不可逆地阻遏 基因复制 使细胞溶解
AST
实验室 临床 评价
S
R
成功
失败
正确的预测
正确的预测 错误的预测
S（FS？） 失败
AST
体外R≈体内R，对R的结果可以相信 体外S≠体内S，对S的结果应持怀疑态度
定义：AST 是一个检测细菌耐药性的 体外抑菌试验（ART）
重要性
如果没有细菌耐药性检测



治疗过度：用药不当，过度使用高档抗生素 治疗错误：用药错误，危重患者丧失抢救时机 增加不必要的副作用 增加不必要的费用 增加细菌的耐药性 降低医疗服务的质量
AST
耐药性统计和分析
100 80 60 40 20 0 东部 西部 北部
WHONET
第一季度 第二季度 第三季度 第四季度

建立本院、本地区和本国的细菌耐药性 监测数据库和网络
AST
小结
药敏试验
ASTART，用体外试验预测体内结果 未经解释、就事论事的报告经过解释、全面的报告 表型的检测耐药机制的检测、耐药流行病学分析 临床用药
2、指导药物学家研究开发新药
抗菌药物发现史 上几个重要的里程碑

1929年，英国细菌学家Flemin发现微生物的 拮抗作用，提示具有临床化疗的可能性。

1940年，Chain和Florey接受美国政府的邀 请，进行青霉素的研究开发，成功用于临床， 开创了化疗新时代。
抗生素时代的开创
——青霉素的发现

（九）利福霉素类 （十）林可酰胺类 （十一）恶唑烷酮类 （十二）链阳菌素类 （十三）抗分枝杆菌药物

二、抗厌氧菌药物
硝基咪唑类 甲硝唑 （Metronidazole） 替硝唑 （Tinidazole） 奥硝唑 （ornidazole）

（一） （二） （三） （四）
细菌耐药性的生物化学机制 生物膜形成
生物膜基质是细菌分泌的多聚物质、吸收的 营养物、代谢产物、细胞溶解产物和当时周围 环境中的微粒材料和碎石组成的复合体。 生物膜基质中的胞外多聚物可与抗菌药物作用， 通过阻止药物进入生物膜的屏障作用或吸附抗 菌药物有效减少药物浓度，从而保护生物膜内 的细菌。 另外，生物膜内相互靠近的细菌，通过耐药质 粒的转移使细菌产生耐药性。

（一） 原理
– 含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂
平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水 分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减 的浓度梯度。在纸片周围可抑菌浓度范围内 测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的 透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌 对测定药物的敏感性，并与该药对测试菌的 最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，MIC越小。
L1
抗生素敏感性试验概述
目的
检测细菌的敏感性，指导临床用药？
检测细菌的耐药性，预测临床结果？
AST
目的 检出细菌对抗生素的耐药性， 预测临床治疗结果 预测 不是指体外测得的数据， 强调对数据的解释 临床 不是指体外AST的结果， 强调病人用药后的疗效 治疗结果 用成功或失败衡量， 强调实验室与临床的统一
制出含各种浓度药物的平板，使用微量多头接种仪 接种细菌，孵育后观察细菌在含不同浓度药物的平 板上的生长情况，以抑制细菌生长的平板所含的药 物浓度测得最低抑菌浓度（MIC）。

(二) （三） （四） （五） （六） （七）
抗菌药物纸片 培养基 细菌接种 结果分析与报告 影响因素 质量控制
E 试验（Epsilometer test）
是一种结合了稀释法和扩散法的原理和 特点测定细菌对抗菌药物的敏感度的定 量技术。 原理：E试条是一种宽5mm、长50mm的商 品化塑料试条，一面固定有干化、稳定 的、浓度呈连续指数增长分布的抗菌药 物，另一面有药物的浓度刻度读数 （μ g/ml）。抗菌药物梯度范围一般为 15-20个自然对数。

细菌耐药性的生物化学机制

抗菌药物渗透障碍
对革兰阴性菌而言，外膜的通透性对药物进 出菌体至关重要。亲水性的药物通道蛋白为 OmpF 、OmpC 和PhoE。抗生素可以直接扩散进 入膜内并到达菌体内相应作用部位 。疏水性越强 的抗生素 、带负电荷越多的抗生素分子 、较大的 药物分子也不易通过 。外膜蛋白的缺失可导致细 菌耐药性的发生 。 细菌的外膜上特殊的药物泵出系统 使菌体内 的药物浓度不足导致耐药 。铜绿假单胞菌外膜上 有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素 ，是产生耐药 的重要机制 。

第四节 细菌耐药性检测方法
一、 细菌耐药表型检测 二、β -内酰胺酶检测

– 碘淀粉测定法（iodometric test）
– 头孢色原菌素纸片法（nitrocefin test）

三、 耐药基因检测
第五节 厌氧菌和结核分枝杆菌 体外抗菌药物敏感试验

一、厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验 二、结核分枝杆菌药物敏感试验

细菌耐药性的生物化学机制
药物作用靶位的改变 通过靶位的改变使抗生 素不易结合，是耐药发生的重要机制。 1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红 霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺 类抗生素耐药 。 2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉 素类抗生素耐药 。 3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药的 重要机制 。

耐药筛选试验 折点敏感试验 双纸片协同试验 药敏试验的仪器化和自动化
（一） （二） （三） （四） （五） （六）

PCR 扩增 PCR-RFLP分析 PCR-SSCP 分析 PCR-线性探针分析 生物芯片技术 DNA测序
细菌耐药性的生物化学机制
灭活酶和钝化酶的产生 1.β-内酰胺酶 水解药物β-内酰胺环使酰胺键断 裂而失去抗菌活性 。 2.氨基糖苷类钝化酶 有3类：乙酰转移酶(AAC)、 磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(AAD)，分别 通过乙酰化作用、磷酸化作用、核苷化作用灭 活此类抗生素。 3.氯霉素乙酰转移酶 4.红霉素酯酶和其他灭活酶
Medical choice Bacteriological choice
（一）常规药敏试验
（一）
肉汤稀释法
– 用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释后,再接种
待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待测细菌的 最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。

（二）
琼脂稀释法
– 将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培养基中，配
第七章 细菌耐药性检测
第一节 临床常用抗菌药物 第二节 抗菌药物体外敏感性试验 第三节 细菌耐药性与产生机制 第四节 细菌耐药性检测方法 第五节 厌氧菌和结核分枝杆菌体外抗菌 药物敏感试验 第六节 抗菌药物治疗效果观察

研究细菌耐药性的目的
1、指导医生及有关专业人员合理用药