IC50计算方法

IC50

是指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。

半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50。在间接竞争ELISA标准曲线中是一个非常重要的数据，标准曲线是一个S型曲线。

ICELISA中，不添加抑制物质的对照孔的OD值为B0，添加了抑制物质的孔的OD值为B

B/B0% 就叫做结合率，在结合率为50%时所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50。

一般IC50的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！

最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最大浓度，即不在曲线范围内的都不准确，大于最大浓度可以稀释后测。

IC50为50%抑制浓度即B/B0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高。

通常来说，试剂盒最大和最小量程应该是该抗体用来检测标准品的检测限，检测限分最大和最小检测限。

检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最小的值；

定量限为实际检测时可以定量的最低的值；

而最大检测限就是实际操作中抑制率达到100%时的药物浓度。

检测下限（LOD）对应的OD值：OD(LOD) =B0－3SD

定量限（LOQ）对应的OD值：OD（LOQ）= B0－10SD

酶活力单位（U，active unit）

酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。

其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。

另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。

Kat和U的换算关系：1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat

酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。

酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用

抑制剂和酶的结合速度要看情况而定，主要和你的抑制剂有关，许多情况下结合得很快，但是也有slow binding inhibitor(我最近做的一个就是，抑

制剂和酶的平衡时间很长，中途加根本看不出变化，必须吧抑制剂和酶一起incubate 15分钟，然后用底物引发).

如果只是IC50，一个底物浓度就够了。但是IC50会随底物浓度的变化而变化，所以你要指定一个底物的浓度，发表IC50的时候要注明你底物的浓度。这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个，感觉上就会不专业。如果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料(并且上面详细注明了所用的酶和底物的浓度，还有对底物的Km)，你当然可以省事的在其它人的底物浓度下测你的IC50。不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定查到的相关数据，最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线。具体怎么做动力学找本书上就有了。简单的就是根据相关资料(新的酶就要看自己的感觉了)设计几个底物浓度，然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线在引发后的几分钟都是线性的，而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总浓度的10％。底物的浓度你要高高低低地试几次，然后估算出Km的大致值(加许多底物让酶饱和，这个时候测出的速度应该是Vmax, Km就是使得速度为Vmax一半的时候的底物浓度)。然后你设计10～15个底物浓度点上及5倍Km，下及1/5Km，注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐弯处。情况好的话你就会拿到那个酶的Michaelis-Menten曲线(X轴底物浓度Y轴速度)，处理后得到Km和Kcat。我觉得最后指定的测IC50的底物浓度要么是Km，要么是3xKm或5xKm(饱和)。

当然如果你有决心的话，最好是做个关于抑制剂的全动力学以得出Ki。具体的方法就是选5～8个底物浓度点，然后在每个底物浓度下测4~6个抑制剂浓度的反应速度，我一般是为保准确每个数据点重复2～3次，工作量不小，但是Ki不受其它因素影响，直接表征抑制剂对酶的结合能力，是适合发表的正式数据

一、原理

噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

二、试剂材料准备与实验仪器

1）对数生长期细胞

2）受试因素（药物）

3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C

4）DMSO（二甲基亚砜）

5）96孔板

6）酶联免疫检测仪

7）细胞培养箱

三、实验步骤（实用于贴壁细胞）

1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞

浓度可以调整。

2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。

3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。

4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5