疟原虫镜检血片的制作与染色

2. 染色用水
常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中 性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、 河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用 pH7.0～7.2水效果最佳。 可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。 配制pH6.6~7.4缓冲液时，先制备好两种贮备液。 贮备液Ⅰ为每1 000ml蒸馏水含9.5g 磷酸氢二钠， 贮备液Ⅱ为每1 000ml蒸馏水含9.07g 磷酸二氢钾。 配制pH6.6~7.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定 比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。
理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原 虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
1.涂制厚血膜
2.推制薄血膜
3.固定薄血膜
4.厚血膜溶血
5.稀释染液及染色
6. 漂洗
7.镜检
制作血膜的注意事项
1.刚涂制的血膜要平放，注意防尘、防虫。厚血膜
未干前勿使血片倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄 不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时 应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及 时装入标本盒并盖严。 2.血膜应自然干燥。切忌在毒太阳下晒或火烤，干透后 才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染 色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶 血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇 固定（1-3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定 后装入盒内盖严，待以后染色。
3.厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响 镜检结果。
4.使用前载玻片一定要清洁，不然会影响血片 制作和镜检结果。 5.配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提 高镜检质量。
6.固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜。 7.冲洗染液时，不要冲走厚血膜。
影响血膜染色质量的因素
血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和 染色技术等有关外，还与下列因素有关: (1) 染剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使 配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分 析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。 新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察 染色是否理想，否则需重新制备染液。 (2) 染液的新旧：新配制的染液，一般染色力较弱，且常 呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染 色前1~2周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免 影响染液质量。 (3) 染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着 色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢， 但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子 及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液 稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效 果。
2. 采血部位及取血方法 采血部位以耳垂较为 合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或 足跟取血。先用75％乙醇棉球消毒取血部位后， 以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深， 然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出 血滴。
3. 涂制厚血膜
取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑 边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部， 用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部 刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中 央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的 圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10 个白细胞为宜）。 厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。 厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱 落，过薄达不到检出率的要求。
谢谢！
吉姆萨（Giemsa）染液
吉姆萨（Giemsa）染液由天青、伊红组成。染料中天青是 碱性的,伊红是酸性的。染色的原理是基于在酸性染料中具 有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染 料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞 成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染 色。 嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色， 称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与 碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中 性颗粒呈等电状态与伊红和天青均可结合，染淡紫色，称为 中性物质。 母液配制后放入冰箱可以长期保存，一般刚配制的母液染色 效果欠佳，保存2-3周后再用较好。
(4) 染色时间：染色时间长，染色效果好，反之则差。染 色时间长短与温度有关，温度高着色快，故染色时间可适 当缩短，温度低染色慢，则时间可适当延长。所以染色时 间长短要随着染液的质量、新旧、浓度及温度而决定。 (5) 稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色好，应使稀释 的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.0~7.2的水稀释。 当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红， 则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时 间，予以校正。 (6) 冲洗方法：染色后不要直接将染液倒掉，应将玻片连 同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使 染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。
8ml
血片制作和染色质量评价标准
好血片制作质量:
厚血膜：血量 4.0～5.0ul,位置 玻片右1／3稍 偏右,直径 0.8～1.0cm，外观 圆形厚膜均匀。 薄血膜：血量 1.5～2.0 ul，位置 玻片1／2～1／ 3处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色； 清洁度 外观光洁无油灰。
4.推制薄血膜
用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘 平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间 向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持 25~35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血 膜，厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重 叠为佳。 薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕。 位置：位于玻片1/2～1/3处。
3. 染色方法
固定薄血膜：要用甲醇或无水乙醇； 厚血膜溶血：用蒸馏水或清水溶血。 少量血片染色：取可取蒸馏水或缓冲液8ml加入吉氏 染液10~12滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染 色20~30分钟，然后水洗、晾干。 成批血片染色：将血膜朝一个方向插入染色缸中，或 每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配 的2％吉氏染液浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染 色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表 面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水， 反复冲洗2~3次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板 上干燥。
5. 厚、薄血膜的位置
每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图
5. 染色前血膜的保存 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血 膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后 才能染色。 血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜 超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血， 影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固 定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干 燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放 置室温中1~2小时后取出血片。
血膜的染色
1. 染色液的制备
疟原虫镜检推荐使用吉氏染液。吉氏染剂不仅适用 于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色 时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血 膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变 质，染色技术也易掌握，被推荐使用。 吉氏染液配制： 吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油 250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分 研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有 塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部 分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至 甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内 放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。
疟原虫镜检血片 的制作与染色
源自文库
血涂片的制作
1. 材料
(1) 载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有 液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾 逐个擦拭，再用清水冲洗干净，凉干，最后用干净、 柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片应先浸泡于 洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中 1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时， 逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净， 再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每10~20张用白纸 包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。 (2) 采血针：使用一次性釆血针。 (3) 玻片盒： (4) 75％乙醇棉球：用于采血前后的消毒。 (5) 标签记号笔：用于玻片上书写号码。