疟原虫血涂片制作作业指导书
疟疾血片制作
薄 血 膜 制 作
▲将推玻片向1的方向稍抽回，当 血液充满推玻片适当宽度（约 2cm）后，以一定均匀的速度 向2的方向滑动（约2.5cm）。
制作薄血膜：
制作薄血膜：
◆血涂片质量评价： 血膜均匀、厚薄度合适、无空泡、无划痕
薄血膜头体尾位置和形状好、无停顿起伏、 两侧留出空间
注意： 血滴大，速度快、角度大 血滴小，速度慢、角度小
血片的制作续…
2、采血时间：症状发作后数 小时至10小时之内。
3、采血部位消毒：用沾有碘 酒的棉棒在患者手指末端、 耳垂、拇趾或足跟（婴幼 儿）从内向外画同心圆。
4、采血：将采血针迅速刺入 取血部位1~2mm深，用大 拇指、食指协同挤出血滴。 第一滴血因含有酒精，用 棉签擦去。再挤出第二滴 血用于制作血片。
二、血片染色
▲血片染色在血片的制作过程中是 一个重要的环节，染色质量的好坏， 直接影响到疟原虫的检出率，也是 直接影响疟疾病例确诊与否的关键。
▲ 疟疾血片的染色有瑞氏染液和吉 氏染液两种，我们现在重点介绍吉 姆萨染液染色法。
血片染色续…
▲ 染液为省寄生虫病防治所统一配制的吉
姆萨染液；为方便开展工作，经省寄生虫 病防治所反复试验，缓冲液选择市面上供 应的娃哈哈矿泉水为佳（在条件允许时配 制pH7.0~7.2的缓冲液为最佳选择）。 ■注：珠海贝索生物技术有限公司生产的 Baso姬姆萨染液：
疟疾血片制作
临沧市疾病预防控制中心
史爱军 2016年3月
主要内容
■血片的制作 ■血片的染色 ■影响血片制作质量的因素及
注意事项
◆重点应掌握的要点：
▲疟疾血片厚、薄血膜的制作要领。 ▲疟疾血片制作注意事项。
▲掌握血片制作技巧、反复练习。
疟原虫镜检技术操作规范
疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。
一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。
玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。
皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。
记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。
（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。
载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。
如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。
用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。
3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。
如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。
二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。
疟原虫血片制作及染色
血膜制作的注意事项
3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干 透后才能用甲醇固定薄血膜，并对厚血膜溶血。 夏天标本尽可能24~48小时内固定、溶血和染色； 冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜 越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色， 薄血膜宜先用甲醇固定，然后用蒸馏水（或过滤 的清水）对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖 严，待以后染色。
标本片
厚、薄血膜的优缺点及其适用范围
厚血膜
用血量约为4μl～5μl,涂制成直径0.8 ～ 1cm的厚血
膜,由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态 上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度 的固缩。受影响较大的有大、裂殖体的形态。
由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时间
，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的15 ～25倍。所以，我们推荐疟疾诊断（门诊检验及现场普
发热期外周血中以环状体（小滋养体）为主，也可见到裂殖 体；
出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。 发作后数小时，间歇期外周血中以大滋养体为主，形态较易
辩认，为诊断的有 利时机；
发作36-48h，可检出裂殖体； 发作1-2次后，配子体出 现较多。
现在六页，总共四十九页。
血膜制作（取血时间）
恶性疟较理想的取血时间是在发作后至 20h内取血，发作 后2小时左右，此时环状体发育至最高峰，初发患者退 热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体， 是在末梢血出现环状 体之后的7-10天。
各种细胞和疟原虫主要是由不同的蛋白质或类氨基酸 组成。不同的氨基酸均含有氨基（NH2）和羧基（COOH ）。在游离状态时，氨基（NH2）获得一个氢离子成为带阳 电的离子（NH3 + ）；而羧基失掉一个氢离子成为带阴电的
7疟原虫及虫卵显微镜检查
粪便水洗沉淀法
肝吸虫卵
大小：最小虫卵（30×20μm） 形状：芝麻、西瓜子 颜色：淡褐色
卵壳厚薄：较厚，疣状突起
卵盖：肩峰突起 卵内含物：梨形毛蚴
肺吸虫卵
大小：比受精蛔虫卵大 形状：椭圆、多态 颜色：金黄色 卵壳厚薄：厚薄不均 卵盖:大、倾斜 卵内含物：卵细胞、 卵黄细胞
文本内容
姜片虫卵
大小：最大的虫卵 形状：长椭圆形 颜色：淡黄色 卵壳厚薄：薄、均匀 卵盖：较小 内含物：卵细胞、 卵黄细胞
疟原虫显微镜检查
张永海 2014.6
病原学检查---厚薄血膜法
2
血涂片制作及染色 1．材料 ：载玻片，消毒棉球，酒精，剪刀，蜡笔，吸 管，蒸馏水，培养皿，姬氏或瑞氏染液，缓冲液等。 方法：薄血膜加厚血膜 厚血膜涂片： 优点：检出率高，用于定性。 缺点：不易鉴别虫种 薄血膜涂片： 优点：容易辨认虫种 缺点：易漏检。
虫卵显微镜检查
粪便检查法
生理盐水涂片法
基本原理：生理盐水作为粪便的稀释剂 ，使病原 体在等渗环境下保持原有形态和活力以利于观察。 适用：产卵量较多或较大的寄生虫。
实验材料：载玻片、盖玻片、竹签、滴管、大便 杯生理盐水、显微镜。
生理盐水涂片法--步骤
1）滴一滴生理盐水在载玻片中央。
2）用竹签取米粒大小的粪便，在生理盐水中混 匀，其厚度能透过粪膜隐约辨认玻片下的字迹为 宜，注意去除粪便渣滓。一般在低倍镜下检查， 镜检顺序，由上至下，由左至右，不要遗漏。如 发现可疑物再转高倍镜观察，加盖玻片 。
棉拭子法
试剂：生理盐水、饱和盐水 （2）仪器：棉棒、载玻片、试管、青霉素小瓶 （3）操作步骤 ①将棉签浸入试管中的生理盐水中，取出时拧去过 多的水滴。 ②清晨排便之前在肛门周围擦拭。
疟原虫血片制作
疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。
2 .染色材料：①姬氏原液②.蒸储水或纯净水：①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。
④脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。
油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。
⑤擦镜纸。
二、采血前准备：1.玻片准备⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。
⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。
⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。
玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。
3.采血时间：⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。
所以在发作后的6〜8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。
⑵。
恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。
环状体的数量和构造。
有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7〜10日后才能在末梢血液在由现，应当注意。
4.采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。
疟疾血片制作
D. 冲洗染液时，水流轻缓，勿冲走厚血膜 。
精品课件
疟疾检测的注意事项
➢ 1.同一个病人的血涂片样本要大于等于5张。 ➢ 2.标本一定要做好标记，上报结果时，一定要
把观察到疟疾病原虫的血涂片标本一起交上来 。 ➢ 3.标本染色时，不要一次把所有标本全部染完 ，分批次染，找到最好的血涂相接触而不相互 重叠为佳。
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血片的制作（厚血膜涂片）
用推片的一角刮取4~5微升血量（相当 于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右 处，由里向外一个方向旋转2圈，涂成直径 0.8~1.0cm的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易 于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油 镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。
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血膜染色前的处理
➢ 固定薄血膜 血片干燥后，用吸有甲醇的吸 管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。注意固 定时甲醇不要接触厚血膜，否则会影响厚血膜 的溶血。
➢ 溶解厚血膜 血片干燥后，用滴管滴水于厚 血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干 。（吉姆萨染色：直接）
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血膜制作注意事项
1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损 2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内 3. 血膜应自然干燥 ，要充分干燥。
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血片的制作（薄血膜涂片）
薄血膜 取洁净的载玻片1张，左手持
载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘 的中点刮取血液1.0~1.5微升（相当于1/4 火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中 线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时， 以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成 舌状薄血膜（约2.5cm长）。
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血片的制作（血膜位置）
通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片 上。方法是将载片分为6等分，第1、2 格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3 格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格 中部。
检查疟原虫的血涂片制作与染色
检查疟原虫的血涂片制作与染色基本原理：疟原虫寄生在红细胞内，经染色后可对疟原虫形态做出鉴定。
材料准备：75%酒精、采血针、推片、载玻片、吉氏染液、甲醇、滴管、刻度管.(1)清洁载玻片的方法：将载玻片用清水清洗干净后晾干，再在稀释清洁液中浸泡1~2天，取出后用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗，烘干，经95%酒精浸泡后，擦干。
清洗过的玻片用干净无油的纸包好备用。
(2)吉氏染液配制：○1原液配制，吉氏染剂粉1g，甲醇50ml，中性甘油50ml。
将吉氏染粉置乳钵中，加少量甘油充分研磨（30min以上），继续边加甘油边研磨，至加完为止。
然后转入烧瓶内，置55~60恒温水浴中，充分震摇使溶解（约2h）,冷却后加入甲醇，储于棕色瓶中，塞紧瓶塞，充分摇匀，1~3周后过滤，即为原液，配制时要研磨充分，不可混入水，配好后要密封，放置越久染色性能越好；○2工作液临时配制：将吉氏原液用pH 6.8~7.2的PBS作1:15~1:20稀释混匀即可。
操作方法：采用疟原虫感染小鼠做血涂片并染色.(但以下采血以人为例)（1）采血:1时间据各种疟原虫在人外周血中出现的规律，间日虐和三日疟患者可在发作后任何时间取血，但以发作后10h 以内最佳，恶性疟原应在发作开始后不久做血检，患者刚开始发作时原虫密度较低可能检测不到，所以应在第二次发作时再做一次以免漏诊：2部位成人可在耳垂或指尖，婴儿宜在脚跟或者大拇指：3方法先用75%酒精给皮肤消毒，右手持一次性无菌采血针迅速刺入皮肤2mm，轻轻挤压周围皮肤，弃去第一滴血，再取1滴作薄血膜，2滴作厚血膜。
薄血膜取血量少，涂面大，原虫分散，但形态清晰，易作虫种鉴别：厚血膜血量多，RBC集中，在原虫数量较少时便于发现，但因制作时细胞相互挤压堆积，原虫形态难认。
（2）涂片：1薄血膜制作取1滴置于洁净载玻片上，用1张磨口边缘作推片。
推片时用力要均匀，一次推成，保证血膜应呈舌形，RBC分布均匀。
2厚血膜制作用推片一角取血2滴，治愈薄血膜片右方用推片角由里向外顺一个方向旋转，使血滴形成直径约1cm的圆形血膜。
疟原虫血片制作染色精讲
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称 很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液 变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液 两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、 J.S.B氏染液等，后者包括利氏 (Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推 荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含 美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以 称为多色性染剂。
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影响染色效果的因素
（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度 过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不 明显或消失。
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影响染色效果的因素
（5）染色时间 染色时间长染色效果好， 反之较差。室温高则着色快，染色时间可 略缩短，气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
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薄血膜血量及涂片法
薄血膜 取洁净的载玻片2张， 1 张平置在桌上，以左手拇 指，食指夹持载玻片两端 （手指切勿接触玻片表面）， 用另一张边缘平滑（最好为 磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取 血部分刮取约1~1.5微升的 血量（相当于 1/4火柴头大 小），使血滴与平置的载玻 片接触，并形成 25~35 度 夹角，待血液向两侧扩展约 2 厘米宽度时，均匀而迅速 地轻轻向左推出（约 2.5 厘 米长）且边缘带有“舌状” 的薄血膜。
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涂制厚、薄血膜的位置
通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法 是将载玻片分为 3 等分（留出标签或磨砂面位 置后的 3 等分）。厚血膜涂在载玻片靠近标签 或磨砂面方向的右1/3中央处，圆形、厚薄均 匀、边缘整齐。薄血膜涂在载玻片 1/2 至左 1/3的中部位置，舌状、厚薄均匀。
间日疟原虫薄血膜涂片标本姬氏染色
(2) 染色：待血膜干燥后，滴加姬氏染液 布满血膜，染色约20分钟。 (3) 冲洗：用蒸馏水轻轻冲去染液，竖直 待干后镜检。
3.观察
A 红细胞 B 、H 淋巴细胞 C 、E、I 中性粒细胞 D 嗜酸性粒细胞 F 单核细胞 G 血小板 J 嗜碱性粒细胞
三、作业: 绘制间日疟原虫红细胞内期各期形
态图。 （滋养体、裂殖体、雌、雄配子体）
一、实验目的: 1.掌握间日疟原虫红细胞内各期形态特点 2.了解薄血膜制作及染色方法
二、实验内容: 1.间日疟原虫薄血膜涂片标本(姬氏染色) 2.伯氏疟原虫感染鼠外周血薄血膜涂片制作 及染色
配子体
红
外
期
裂
体
增
殖
红细胞内
裂体增殖
环状体
大滋养体
ห้องสมุดไป่ตู้
早期裂殖体
晚期裂殖体
雄配子体
雌配子体
薄血膜制作及染色操作方法
采血
推片
干燥
固定
干燥
染色
20分钟
冲洗
干燥
观察
1.薄血膜制作
a
b
c
30 °-45°
d
a. 滴一小滴血于玻片一 端1/3处。
b. 推片放在血滴前方， 向后拖与血滴接触。
c. 血滴展开后，两玻片 呈30°-45°夹角。
d. 推片向另一端匀速 推动，推成均匀薄血膜.
2.染色
(1) 固定：待血膜自然干燥后，滴一滴甲 醇于血膜上。
疟原虫血片制作方法
血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂
呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称 厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。
发热病人血片
标本片
血膜的制作（取血时间）
取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期 疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。
15.聚光器
8.接物镜
16.虹彩
17.滤光镜圈 18.反光镜
血片的镜检
1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各 种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。
2.学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握 薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。
3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类 时参考和血片编号之用。
取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头， 通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针 采血，一人一针，避免血传疾病）。先用 75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手 捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精 干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方， 右手持消毒针迅速刺入耳垂下端1~2毫米， 不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向 挤压出血。
（涂片操作）
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血 量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成 直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀， 过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。
血膜的制作（涂片操作）
涂制厚、薄血膜的位置 通常是将厚、薄血膜 涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分， 第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3 格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。 作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个； 门诊和发热病人血片每片1人，涂
415疟原虫血片制作染色-32页精选文档
2020/4/27
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制作血膜的注意事项
2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内或者 实验台面上。厚血膜未干前勿使标本片倾 斜，以免未干的血膜倾向一侧，造成血膜 厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检 查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍 蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装 入标本盒内。新木制标本盒需敞开放置一 段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚 血膜血红蛋白被其固定，不能溶血或染色 效果不佳。
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染色原理：伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性 水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离 解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸 性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、 嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的 沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰 离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的 胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合 染成兰色。
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血片的染色
（一）染液的种类及染色原理
染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称 很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液 变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液 两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、 J.S.B氏染液等，后者包括利氏 (Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推 荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含 美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以 称为多色性染剂。
血片制作所需设备
载玻片 具有磨砂面，且规格是玻片宽度乘长度在 25.2*75.2mm，厚度1mm~1.2mm为好。
推玻片 有专用的。但现在一般选择边缘光滑整齐的载玻 片替代推玻片。
采血针 使用一次性的采血针。 玻片盒 木制/塑料均可以。 75%酒精棉球 用于采血部位的消毒。 记号笔/B2铅笔 用于载玻片上编写号码。
疟原虫(MP)厚血片检查法(手工法)的标准操作规程
疟原虫镜检血片制作与染色操作流程
1．填写登记表在“疟疾发热病人血检登记本”上为患者编号并登记其相关信息。
2．清洁玻片
3．玻片编号用目测法将玻片分成六等分，左侧第一和等二等份用于编号。
同一患者玻片上号码应与登记本上一致。
4．采血
5．涂制厚厚片
（1）血量: 4～5微升
（2）位置：玻片第三等份中央的位置
（3）血膜大小：0.8～1.0厘米
6．涂制薄血膜
（1）血量: 1～1.5微升
（2）位置：玻片第四至第六等份的位置。
涂制薄血膜的血应滴在玻片中央稍偏右的位置
（3）血膜大小：2.0厘米(宽)×2.5厘米(长)
7．吉氏染色液配制
（1）2%的吉氏染色液配制方法98毫升蒸馏水加入2毫升吉氏原液，混匀后即为2%的吉氏染色液。
也可用1支试管，按1毫升蒸馏水加入1滴吉氏原液的比例稀释染液，混匀后用于染色。
（2）注意事项2%的吉氏染色液必须现配现用。
8．吉氏染色方法
（1）待厚血膜干燥
（2）甲醇固定薄血膜
（3）待甲醇挥发干净
（4）滴2%的吉氏染液覆盖厚薄血膜，染色30分钟。
（5）取出染好的血片，连同染液在清水中轻轻漂洗一遍，洗去表面吸附的杂质。
（6）放置干燥处晾干。
血膜面朝上，注意不要放反了。
疟原虫镜检血片的制作与染色.
2. 采血部位及取血方法 采血部位以耳垂较为 合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或 足跟取血。先用75％乙醇棉球消毒取血部位后， 以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深， 然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出 血滴。
3. 涂制厚血膜
取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑 边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部， 用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部 刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中 央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的 圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10 个白细胞为宜）。 厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。 厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱 落，过薄达不到检出率的要求。
5. 厚、薄血膜的位置
每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图
5. 染色前血膜的保存 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血 膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后 才能染色。 血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜 超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血， 影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固 定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干 燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放 置室温中1~2小时后取出血片。
8ml
血片制作和染色质量评价标准
好血片制作质量:
厚血膜：血量 4.0～5.0ul,位置 玻片右1／3稍 偏右,直径 0.8～1.0cm，外观 圆形厚膜均匀。 薄血膜：血量 1.5～2.0 ul，位置 玻片1／2～1／ 3处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色； 清洁度 外观光洁无油灰。
理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原 虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
疟原虫血涂片制作作业指导书
疟原虫血涂片制作作业指导书1.目的指导实验室人员制作血涂片，完成疟原虫检测工作2.适用范围适用于实验室检测人员3.职责疟原虫血涂片制作人员负责涂片编号及保存，4.作业指导4.1样本采集及要求4.1.1采用抗凝管采血：或在采血管里加入抗凝剂，将采集血样加入并摇匀，备用4.1.2指尖血、静脉全血（抗凝血）样本均可适用4.2血涂片的制作：4.2.1血膜种类和位置薄血膜：占玻片的近1/2。
将血液涂呈薄膜状，血细胞平辅在玻片上面厚血膜：占玻片的1/6。
血液涂成圆形，血量多4.2.2厚血膜的制作用推片的一角，刮取约4 ~ 5ul(火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外旋转，转4~ 8圈直径0.8 ~ 1cm圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。
厚血膜厚度以油镜视野可见5 ~ 10个白细胞为宜。
厚血膜血量：4~5ul微升，外形：圆形，直径0.8~1.0cm4.2.3薄血膜制作取洁净的载玻片2张，1张以左手拇指，食指夹持载玻片两端，用另一张边缘平滑的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点取血约1~1.5ul的血量（小米粒大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25~30度夹角，待血液向两侧扩展宽约2cm时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5cm长）薄血膜血量：1~1.5ul位置：玻片1/2外形：薄度均匀、无痕、长度：2.0~2.5cm4.2.4血膜编号：血膜编号：血膜制成后，以防差错，待薄血膜干后用B2铅笔，在薄血膜的右上角或血膜底部，写上受检者的个人编号。
4.3血涂片固定及染色4.3.1甲醇固定薄血膜载玻片略向下倾斜，从一侧挤出甲醇，试管平推下划即可。
甲醇不能触碰到厚血膜4.3.2单张染色法在量筒内加2ml缓冲液或ph7.0~7.2净水，滴加吉氏原液4滴(每ml2滴），混匀，然后滴在已充分干躁的厚薄血膜上，染色30min。
1张玻片需2ml水，2滴／ml染液，染色25-30min4.3.3染色效果血膜蓝中带紫色，如果血膜颜色偏红色, 说明染色偏酸性；血膜偏蓝色, 则为偏碱性。
疟原虫涂片实验报告
一、实验目的1. 掌握疟原虫涂片制作的方法。
2. 熟悉疟原虫形态学特征，学会识别疟原虫种类。
3. 了解疟疾的实验室诊断方法。
二、实验原理疟疾是由疟原虫引起的一种严重传染病，主要通过按蚊叮咬传播。
疟原虫在人体内寄生，经过多个发育阶段，最终在红细胞内繁殖。
血涂片检查是诊断疟疾的重要方法之一，通过显微镜观察血涂片中的疟原虫形态，可以确定疟原虫的种类，为临床诊断和治疗提供依据。
三、实验材料1. 试剂：抗凝剂EDTA-Na2/K2、吉姆萨染液、蒸馏水。
2. 仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、移液器、酒精灯、吸管等。
3. 样本：疑似疟疾患者的血液样本。
四、实验步骤1. 采集血液样本：使用EDTA-Na2/K2抗凝管采集患者外周静脉血2-5mL。
2. 制作血涂片：a. 将血液样本滴在载玻片中央，形成直径约1cm的圆形。
b. 用另一张载玻片边缘轻刮血液，制成薄而均匀的血膜。
c. 待血膜干燥后，用盖玻片覆盖。
3. 染色：a. 将载玻片放入吉姆萨染液中，浸泡5-10分钟。
b. 用蒸馏水冲洗载玻片，去除多余染液。
c. 待载玻片干燥后，用显微镜观察。
4. 观察与鉴定：a. 使用低倍镜观察血涂片，寻找疟原虫。
b. 使用高倍镜观察疟原虫的形态学特征，如细胞核、滋养体、裂殖体等。
c. 根据疟原虫的形态学特征，确定疟原虫的种类。
五、实验结果1. 在血涂片中观察到疟原虫，经鉴定为恶性疟原虫。
2. 疟原虫的形态学特征如下：a. 细胞核呈红色，圆形或椭圆形。
b. 滋养体呈圆形或椭圆形，大小约为10-15μm。
c. 裂殖体呈椭圆形，大小约为20-30μm。
六、实验讨论1. 本实验成功制作了疟原虫血涂片，并成功鉴定出恶性疟原虫，验证了实验原理和步骤的正确性。
2. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 采血时，应选择患者发作期进行，此时疟原虫数量较多，易于观察。
b. 制作血涂片时，应确保血膜薄而均匀，避免过厚或过薄。
c. 染色时，应控制好染色时间，避免染色过深或过浅。
疟原虫血涂片及形态识别
二、疟原虫各期的形态特点：
间日疟原虫大滋养体
间日疟原虫大滋养体：
薛氏点 疟色素
模式图
返回
实物照片
间日疟原虫早期裂殖体
恶性疟原虫环状体
间日疟原虫成熟裂殖体
间日疟原虫雄配子体
间日疟原虫雌配子体：
模式图
返回
实物照片
间日疟原虫雌配子体
恶性疟原虫雌配子体
恶性疟原虫雄配子体
间日疟原虫环状体
.
一、疟原虫血涂片：
1、薄血膜血涂片：指血膜制备应薄些，其他制备要求 同一般血涂片。涂片在显微镜下红细胞应不重叠，这 有利于观察红细胞内疟原虫一大滴，滴于玻片上，以推片的 一角，将血滴自内向外做螺形摊开，使之成为直径约1cm 大小、厚薄均匀的厚血膜。待厚血膜完全干后，（如再用 火焰固定有助于细胞粘在玻片上），加2-3滴蒸馏水在厚血 膜上使红细胞溶解，待血膜呈灰白色时，去掉血膜上的水， 血膜干后进行瑞氏染色，并在油镜下观察。厚片法疟原虫 的检出率比薄片法高，但由于厚片中疟原虫结构不清楚而 易误认为杂质，环转体也不易观察到，所以对于经验不足 的检验人员来说厚片法也很容易漏诊。
2013年.4.15疟原虫血片制作染色
18
血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法
血膜干燥后，用甲醇或无水酒精固定薄血膜，用过滤 清水或自来水对厚血膜溶血，然后再进行染色。 成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染 色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性 蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染 色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时 间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲 洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干 板上，待干镜检。
直径 外观 血量 位置 直径 外观
<0.7或>1.2cm 厚薄不匀影响着色 过多或过少 偏右或偏左过多 过多或过少 厚薄不匀呈波浪型，有划痕 厚血膜全脱落
圆形厚膜均匀， 边缘整齐
1～1.5ц l 玻片1/2～1/3处 2.0～2.5cm 舌状厚薄均匀， 无划痕 厚血膜完整
伊红在水溶液内遇到美兰或天青，即可互相化合而产生沉 淀从而失去染色力，因此，吉氏染液的母液绝对不能进水。
2018/9/2 17
血片的染色 （二）吉氏染液母液配置方法
取吉氏粉0.5克置于研钵中， 加少量甘油充分研磨，再加再磨， 至25毫升加完为止，倒入60或 材料： 100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。 在研钵中加少量甲醇，洗去甘油 1、吉氏粉0.5克 染液混入瓶内，至25毫升甲醇 2、甘油25毫升 洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶 3、甲醇25毫升 塞，充分摇匀，置于55~60℃ 水浴中或温箱内24小时或室温 内3~5天，多加摇动，即成原 液。吉氏染液是目前较优良的血 膜染剂，即使在炎热天气中，亦 可经久不变。 2018/9/2
血片制作和染色质量标准
项目 检查 内容
血量 位置
质量标准 好
4～ 5ц l 玻片右1/3 0.8～1.0cm
疟疾血膜制作及染色技术
疟疾血膜制作及染色技术一、血片的制作1.材料准备载玻片：新玻片浸入有液态洗涤剂的清水中10-20分钟，干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干备用。
1. 2. 采血针：一次性 . 玻片盒：防止污染和昆虫吸食血膜 1. 4. 75%酒精棉球：采血前后消毒 . 记号笔：玻片上书写号码2.血片的制作（厚、薄血膜）用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。
最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。
薄血膜涂片薄血膜取洁净的载玻片1张，左手持载玻片平置,右手持推片，推片一端边缘的中点刮取血液~微升（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片中线接触，待血液向两侧扩展约2cm宽时，以25°～35°夹角均匀而迅速地向左推成舌状薄血膜（约长）。
厚度以薄血膜上的红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。
厚血膜涂片用推片的一角刮取4~5微升血量（相当于火柴头大小），使血滴涂于载玻片的中央偏右处，由里向外一个方向旋转2圈，涂成直径~的圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求（厚度以1个油镜视野内可见5~10个白细胞为宜）。
血膜位置通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。
方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编用；厚血膜涂在第3格中央；薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。
血片的制作编号血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码（姓名）、单位(地址)、制片日期、以防差错；待血膜干后依次按顺序插入标本盒内。
血膜制作注意事项1. 清洗玻片，且勿碰撞、磨损2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内3. 血膜应自然干燥，要充分干燥。
二、血片染色：（吉氏染液的染色方法）1. 血膜染色前的处理固定薄血膜血片干燥后，用吸有甲醇的吸管在薄血膜表面轻轻涂抹，自然干燥。
注意固定时甲醇不要接触厚血膜，否则会影响厚血膜的溶血。
溶解厚血膜血片干燥后，用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，晾干。
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疟原虫血涂片制作作业指导书
1.目得
指导实验室人员制作血涂片，完成疟原虫检测工作
2.适用范围
适用于实验室检测人员
3.职责
疟原虫血涂片制作人员负责涂片编号及保存,
4、作业指导
4、1样本采集及要求
4、1、１采用抗凝管采血：或在采血管里加入抗凝剂，将采集血样加入并摇匀，备用
4、１、2指尖血、静脉全血（抗凝血)样本均可适用
４、2血涂片得制作：
４、2、１血膜种类与位置
薄血膜：占玻片得近1/２.将血液涂呈薄膜状，血细胞平辅在玻片上面
厚血膜:占玻片得1／６。
血液涂成圆形，血量多
得载玻片接触,再由里向外旋转,转４~ 8圈直径0、8 ~ 1cm圆形厚血膜,血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率得要求.厚血膜厚度以油镜视野可见5 ～１0个白细胞为宜。
厚血膜血量：4～５ul微升，外形：圆形，直径0、８～１、0ｃm 4、2、3薄血膜制作
取洁净得载玻片2张,１张以左手拇指,食指夹持载玻片两端,用另一张边缘平滑得载玻片做推片，用推片一端边缘得中点取血约1～1、5uｌ得血量(小米粒大小），使血滴与平置得载玻片接触,并形成２5~30度夹角,待血液向两侧扩展宽约2cｍ时,均匀而迅速地轻轻向左推出(约2、５cm长)薄血膜血量：1～1、5ul位置：玻片1/2外形:薄度均匀、无痕、长度:２、0~2、5cｍ
4、２、４血膜编号:血膜编号：血膜制成后，以防差错,待薄血膜干后用B2铅笔，在薄血膜得右上角或血膜底部,写上受检者得个人编号。
4、3血涂片固定及染色
４、３、1甲醇固定薄血膜
载玻片略向下倾斜，从一侧挤出甲醇，试管平推下划即可.甲醇不能触碰到厚血膜
4、３、2单张染色法
在量筒内加2ml缓冲液或ph７、0～7、2净水, 滴加吉氏原液4滴(每ｍl２滴),混匀,然后滴在已充分干躁得厚薄血膜上，染色３０mｉn。
1张玻片需２ml水,2滴／ml染液，染色2５—30min
４、3、3染色效果
血膜蓝中带紫色,如果血膜颜色偏红色, 说明染色偏酸性;血膜偏蓝色, 则为偏碱性。
4、4注意事项与其它因素
４、4、１载玻片必须清洁无油污,拿玻片时拿侧楞,固定薄血膜时,甲醇不要触碰到厚血膜，放置３天以上得血片，在染色之前先用清水滴加在厚血膜上进行溶血，再进行染色，厚血膜干燥时不要高温加热，充分干燥后方可染色已稀释得吉氏染液，须在30分钟内用完,冲染液时,要漂洗以免冲掉厚血膜，将血膜标本（血膜面朝下）插于凉干板上晾干。
4、4、2薄血膜过厚原因：使用血滴过大、玻片与推片之间夹角过大、展开血膜得动作太快
４、4、３血膜脱落原因、载玻片不干净、血量多血膜厚、血膜没干透、冲洗方法不当
4、4、４、染料溶剂得质量
染液（母液)在使用时避免水对其污染，用专用无水得滴管取染液.染液得新旧：
新配制得染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。
染液存放时间越久，染色力越强.通常在染液配制１~2周后才使用,盛装染液得瓶子应加塞盖密,以防吸潮而影响染液质量。
染液稀释后使用时间：吉氏染液得主要成份就是美蓝、伊红与由美蓝氧化产生得天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝与天青即产生沉淀.因此，必须在稀释染液当时使用,一般在半小时内染色力最强.染液得稀释浓度染液得浓度高其着色快而深,染液得浓度低其着色慢而浅或发绿。
染色时间染色时间长染色效果好，反之较差。
室温高则着色快，染色时间可略缩短,气温低可适当延长.染色用水染液得稀释用水偏酸或偏碱,可用缓冲蒸馏水调整.染色后发现血膜颜色偏蓝(偏碱）或偏红(偏酸)时，可用与之相反得酸、碱度水冲洗血片予以纠正染色后不要直接将染液倒掉沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出,并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。
4、４、５刚涂制得血膜要平放在标本盒内,厚血膜未干前勿使标本盒倾斜,以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不
易溶血与着色而影响检查结果。