疟原虫检测 血涂片镜检法
疟原虫镜检技术操作规范
疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。
一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。
玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。
皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。
记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。
（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。
载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。
如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。
用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。
3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。
如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。
二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。
疟原虫镜检操作流程
疟原虫镜检操作流程疟原虫镜检操作可有趣啦，就像一场小小的探索之旅呢。
一、准备工作。
咱们先得把要用的东西都找齐喽。
那需要啥呢？显微镜肯定是必不可少的啦，就像战士上战场不能没有枪一样。
然后就是载玻片和盖玻片，这俩就像是舞台和舞台上的小屋顶，疟原虫就在这上面表演呢。
还有采血针、酒精棉球这些小物件，采血针用来取血，酒精棉球用来消毒，它们可都是小助手。
另外，染色剂也得准备好，这染色剂就像是给疟原虫化妆的东西，能让咱们把疟原虫看得更清楚。
二、采血。
采血这一步可得小心点儿。
找个舒服的地方让被采血的人坐好或者躺好，别让人家紧张，就像跟朋友聊天似的，说“放松哈，就一下下，不疼的”。
用酒精棉球在手指尖或者耳垂轻轻擦一擦，消消毒。
然后拿起采血针，就像拿一支小小的魔法棒，轻轻一扎，血就出来啦。
把这一滴血小心地滴在载玻片的一端，可别滴太多，也别滴到外面去了，一滴小小的、圆圆的血滴就像一颗红色的小珍珠在载玻片上呢。
三、涂片。
血滴在载玻片上了，咱们就要开始涂片啦。
拿另一个载玻片的一端，轻轻地斜着靠在有血滴的载玻片上，就像小滑梯一样。
然后慢慢地把这个载玻片往前推，让血滴在两个载玻片之间均匀地铺成薄薄的一层。
这一步可有点像画画的时候把颜料涂开，要涂得薄厚均匀才好呢。
如果涂得太厚了，疟原虫就会像躲猫猫一样藏在里面，咱们就不容易看到它啦；要是涂得太薄了，可能疟原虫都没几个在上面，也不好找。
四、固定和染色。
涂片弄好之后呢，要固定一下。
这就像是给疟原虫拍个照片定住它的样子。
可以用小火苗稍微烤一烤载玻片，不过得小心别烤糊了，要不然疟原虫就被烤成小焦炭啦。
固定好之后就到染色的时候了。
把染色剂小心地滴在涂片上，让染色剂把疟原虫包裹起来，就像给疟原虫穿上一件彩色的衣服。
等染色剂在涂片上待一会儿，就像让疟原虫在染缸里泡个澡，把自己染得美美的。
五、镜检。
终于到了最激动人心的镜检啦。
把载玻片放在显微镜的载物台上，就像把宝贝放在展示台上一样。
先从低倍镜开始看，慢慢地转动粗准焦螺旋，让镜头一点点靠近载玻片，就像在寻找宝藏一样。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术概述血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足心影响检查的结果，必须把握好“三关”。
玻片清洁。
清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。
在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染玻片。
新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。
①5%的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，将洁干毛巾擦净后待用。
②清洁液浸泡法：清洁液配制如下：重铬酸钾 80g 浓硫酸100ml 水清净水 1000ml 二、制片 1.薄血膜涂制 2.厚血膜涂制薄血膜厚血膜标记处 1.薄血膜涂制： 1.薄血膜涂制 1 先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。
2 用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。
3 取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。
血量1-1.5mm3 .1/4火柴头大小。
薄血膜涂好后，再轻挤耳垂挤出约火柴头大一血滴，将这一滴血滴在玻片的中心1/3处然后用推片的一角由血滴中央向周围旋转涂成直径约一厘米的圆形血膜，旋转涂制时间不宜过短，以免形成纤维蛋白束，遮盖了疟原虫。
厚血薄涂好后，应平放待干，防苍蝇舔食血膜或灰尘落在上面。
受检者的编号可用铅笔或钢笔写在薄血膜的边缘上，也可用蜡笔写在厚血膜一端。
血片制作和染色质量规范质量控制血片制作和染色质量判定标准 1.血片制作质量判定标准：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。
中：薄血膜中，厚血膜好或中。
差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。
质量控制 2.血片制作和染色合格率要求：分别以血片制作、染色和清洁度的好、中、差合并计算合格率。
疟原虫镜检操作流程
疟原虫镜检血片制作与染色操作流程
1．填写登记表在“疟疾发热病人血检登记本”上为患者编号并登记其相关信息。
2．清洁玻片
3．玻片编号
用目测法将玻片分成六等分，左侧第一和等二等份用于编号。
同一患者玻片上号码应与登记本上一致。
4．采血
5．涂制厚片
（1）血量: 4～5微升
（2）位臵：玻片第三等份中央的位臵
（3）血膜大小：0.8～1.0厘米
6．涂制薄血膜
（1）血量: 1～1.5微升
（2）位臵：玻片第四至第六等份的位臵。
涂制薄血膜的血应滴在玻片中央稍偏右的位臵
（3）血膜大小：2.0厘米(宽)×2.5厘米(长)
7．吉氏染色液配制
（1）2%的吉氏染色液配制方法98毫升蒸馏水加入2毫升吉氏原液，混匀后即为2%的吉氏染色液。
也可用1支试管，按1毫升蒸馏水加入1滴吉氏原液的比例稀释染液，混匀后用于染色。
（2）注意事项2%的吉氏染色液必须现配现用。
8．吉氏染色方法
（1）待厚血膜干燥
（2）甲醇固定薄血膜
（3）待甲醇挥发干净
（4）滴2%的吉氏染液覆盖厚薄血膜，染色30分钟。
（5）取出染好的血片，连同染液在清水中轻轻漂洗一遍，洗去表面吸附的杂质。
（6）放臵干燥处晾干。
血膜面朝上，注意不要放反了。
疟原虫的镜检技术-制片染色
利用特异性抗体对疟原虫进行染色， 提高疟原虫的染色效果和特异性。
人工智能在疟原虫镜检中的应用
图像识别与分类
利用人工智能技术对显微镜下的疟原虫图像进行自动识别、分类和计数，提高镜 检的准确性和效率。
数据挖掘与分析
通过人工智能技术对疟原虫镜检数据进行分析和挖掘，发现数据间的关联和规律 ，为疟疾防控提供科学依据。
固定涂片时要选用适当的 固定剂，避免涂片脱落。
染色时要选用适当的染色 剂，按照染色剂的要求进 行操作，确保染色效果良 好。
镜检时要仔细观察疟原虫 的结构特征，避免误诊和 漏诊。
冲洗时要彻底去除多余的 染料和杂质，避免干扰观 察。
03
疟原虫镜检制片染色技 术
疟原虫镜检制片染色技术的原理
原理概述
疟原虫镜检制片染色技术是一种 用于检测疟原虫的病理学方法。 通过制备血液涂片，并对其进行 染色，可以观察到疟原虫的存在
疟原虫镜检技术的应用场景
在疟疾流行地区，疟原虫镜检技 术常用于对疑似疟疾患者进行快
速诊断，以指导治疗和防控。
在实验室研究中，疟原虫镜检技 术可用于研究疟原虫的生物学特 性、药物敏感性以及疫苗开发等
方面。
在公共卫生领域，该技术也可用 于监测和评估疟疾的流行趋势和
传播风险。
02
制片染色技术
制片染色技术的原理
疟原虫的镜检技术-制 片染色
目 录
• 疟原虫镜检技术简介 • 制片染色技术 • 疟原虫镜检制片染色技术 • 疟原虫镜检制片染色技术的发展趋势
01
疟原虫镜检技术简介
疟原虫镜检技术的定义
01
疟原虫镜检技术是指通过显微镜 观察疟原虫在人体内的形态、结 构和生长过程，从而对疟疾进行 诊断和研究的实验技术。
各级医疗机构医院疟原虫检测血涂片镜检法
各级医疗机构医院疟原虫检测血涂片镜检法1 范围本标准规定了血涂片镜检法检测疟原虫的技术规范。
本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1疟原虫Plasmodium spp疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。
寄生于人体的疟原虫主要有恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）等。
2.2血涂片 blood films将血液涂制于载玻片上制成的涂片。
供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。
3 仪器和器材3.1 生物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×目镜）。
3.2 计数器。
3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片）。
3.4 推片。
3.5 血片染色架。
3.6 血片干燥架。
3.7 玻片盒。
3.8 染色盘和染色缸。
4 试剂和材料4.1 吉氏染色原液。
4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
4.3 甲醇（分析纯）。
4.4 香柏油或专用浸油（折射率≥1.5）。
4.5 二甲苯（分析纯）。
4.6 75%酒精。
4.7 一次性采血针。
4.8 一次性手套。
5 检测步骤5.1 血涂片的制作5.1.1 采血部位及取血方法经75%乙醇消毒采血部位，待干后，用一次性采血针在耳垂或指端扎刺取血，婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血。
取1张已消毒推片，用拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液4μL～5μL用于制作厚血膜，再用该端中部刮取血液1μL～1.5μL用于制作薄血膜。
5.1.2 厚血膜制作取1张载玻片，将推片左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径0.8cm～1.0cm 的圆形厚血膜,厚度以1个油镜视野内可见到5个～10个白细胞为宜。
疟原虫镜检技术
•
甘油
3ml
•
纯甲醇
97 ml
• 将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油
充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒 入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中 的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。 充分摇匀，一般放置一二星期后，再过滤
应用（保存时间愈久，染色力愈佳）。
• 急用时，放置24小时后过滤也可使用。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（2）缓冲液的配制
PH M/15 Na2HPO4 M/15 KH2PO4
(ml)
( ml)
DW (ml)
6.8
49
51
900
7.0
63
37
900
7.1
68
32
900
7.2
73
27
900
7.4
81
19
900
• 加缓冲液的PH可用试纸或0.02%酚红液测定。
• 亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好。
• （1）两种贮备液的配制：
• 贮备液I • •
1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液
Na2HPO4 9.5 g 蒸馏水 1000 ml
• 贮备液Ⅱ 1/15M磷酸二氢钾 （KH2PO4 ）溶液
•
KH2PO4 9.07 g
•
蒸馏水 1000 ml
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、显微镜镜检用于疟疾诊断
• 显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断
技术(金标准）
• 主要优点
- 特异高 - 能区分虫种 - 能分期 - 能计数 - 1小时内能完成诊断程序
检查疟原虫染应采集的标,本
检查疟原虫染应采集的标,本
疟疾检测方法:血涂片找疟原虫，检测流程:确定采血对象，采集标本，核对化验单，记录相关登记本，制作血涂片，最后在显微镜下找疟原虫。
1.疟疾检测流程:
(1)采血对象。
临床诊断为疟疾、疑似疟疾和不明原因的发热病人。
(2)化验单，由临床医师开具化验单，嘱咐患者到化验室血检，检验者核对患者信息。
(3)镜检人员对血检对象按照登记本要求进行登记。
(4)消毒采血部位，用75％乙醇对采血部位消毒，采血部位多在手指末端。
也可在耳垂采血。
(5)待采血部位干后，采集血标本。
(6)血膜制作，取清洗过的玻片2张，1张做载片、1张做推片，要求推片的一侧边缘光滑、用右手大拇指和食指夹持推片中部。
(7)血膜染色，建议首选姬姆萨氏染液。
先用甲醇固定薄片。
完全晾干后与厚片同时染色。
如选用瑞氏染色则先滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血至灰白色，倾去水滴、晾干后按说明进行染色。
(8)镜检。
2.风险提示:疟疾为乙类法定传染病，通过按蚊叮咬接触传播，血检阳性，应及时到专科医院进行规范治疗。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术一、疟原虫的生物学特征疟原虫是一类单细胞真核生物，寄生在人类和其他脊椎动物的红细胞内。
常见的疟原虫种类包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等。
疟原虫的生活史包括在人体内的无性生殖和在蚊体内的有性生殖两个阶段。
在人体内，疟原虫经历了肝细胞内的红外期和红细胞内的红内期发育过程。
了解疟原虫的生物学特征对于选择合适的检验方法具有重要意义。
二、疟原虫检验技术的分类1、显微镜检查法这是疟原虫检验的经典方法，包括薄血膜涂片和厚血膜涂片检查。
薄血膜涂片用于疟原虫形态学观察，可鉴定疟原虫的种类；厚血膜涂片则提高了疟原虫的检出率。
在显微镜下，观察疟原虫的形态、大小、细胞核和细胞质的特点，以及疟色素的分布等，从而确定是否感染疟原虫以及感染的种类。
2、免疫学检测法（1）抗原检测利用免疫层析技术检测患者血液中的疟原虫抗原。
这种方法操作简便、快速，适用于现场检测和大规模筛查。
（2）抗体检测检测患者血清中的特异性抗体。
但由于抗体在感染后一段时间才会产生，且抗体检测不能区分现症感染和既往感染，因此在疟疾诊断中的应用相对有限。
3、分子生物学检测法（1）PCR 技术通过扩增疟原虫特定的基因片段来检测疟原虫。
具有高度的敏感性和特异性，能够检测到极低浓度的疟原虫核酸。
（2）核酸杂交技术利用标记的核酸探针与疟原虫核酸进行杂交，从而检测疟原虫。
4、其他检测方法（1）血常规检查疟疾患者可能会出现贫血、白细胞减少等血常规异常。
（2）血生化检查部分疟疾患者可能会有肝肾功能损害，通过血生化检查可以了解相关情况。
三、显微镜检查法的操作步骤1、采血通常采集患者的末梢血或静脉血。
2、制作血涂片薄血膜涂片：将一滴血液滴在载玻片的一端，用推片以 30°－45°角均匀地推成薄而均匀的血膜。
厚血膜涂片：取较多的血液滴在载玻片上，用推片制成较厚的血膜。
3、固定和染色薄血膜涂片自然干燥后，用甲醇固定，然后用吉姆萨染液或瑞氏染液染色。
疟原虫镜检技术
细胞计数(国际标准) 。
白细胞疟原虫计数法
●例如 计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患
者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为： 35（计数的疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数） =1400 / μl 答：该患者的疟原虫密度为1400 / μl。
2. 原虫细胞浆呈条带状或方形
3. 成熟裂殖体呈菊花状 4. 裂殖子数通常为6-12个 5. 齐氏点（西门氏点）较少见
卵形疟原虫形态特征
1. 被寄生红细胞正常大小或略涨大，边 缘呈彗星状也称齿轮状 2. 疟原虫通常呈椭圆形 3. 薛氏点与间日疟相似
4. 裂殖子数通常为6-12
● 四种人体疟原虫都有双核和多重感染现象
red cell
A typical Plasmodium malariae presentation
Female patient, arrived from Brazil two weeks previously. Flu like symptoms since arrival.
● 间日疟原虫分布于我国大部分地区, 中部 地区病例较多 ● 病程良性, 有复发
三日疟 P.malariae
●遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，呈片状、 块状分布 ●三日疟在我国非常少见，只在南方有散在报告
卵形疟 （蛋形疟） P.ovale
● 主要分布非洲。缅甸、东南亚有散在报告 ● 在我国卵形疟消灭
P. ovale
(P.m.)
(P.o.)
恶性疟 P.falciparum
● 分布热带、亚热带地区，是非洲的重要疾病 ● 我国流行区域为云南省和海南省 ● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染 后出现急性症状,不及时治疗可危及生命（脑 型疟）
疟原虫的镜检技术-制片染色
注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染 液的pH值7.0-7.2较好。 染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合， 使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞 和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时， 红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色， 不易观察。
姬氏染液的染色方法
血片干燥后,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）, 再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白(新制作的也可直接染色)，然后 再进行染色。 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入 3%姬氏染液稀释液（3毫升姬氏原液加缓冲液或蒸馏水97毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30-40min（根据当地实际 情况，酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液漂洗干净， 将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液2-3滴，加缓冲液 或蒸馏水1ml，混合均匀，染色15-20分钟左右，然后用清水轻轻 将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。（勿直接倾倒掉玻片上的染 液，防止渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检） 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈 蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
染液的种类
疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏 （Wright stain）和姬氏染液（Giemsa stain）。 这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美 蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。 我们主要用姬氏染液，它具有方便，染色效果稳 定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间 短，但染色效果不如姬氏稳定，主要在门诊量大 的门诊实验室使用。
染液的染色原理
是染料与被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一 种化学反应。 红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出 的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带 的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。 疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟 原虫和白细胞核被染成紫红色。
疟原虫检验技术
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法：
标准血片
门诊发热病人血片 居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少
●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
血片染色
两种染色方法: ●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B typ来自) 5g疟原虫人类四种疟原虫的 基 本特征
感染人的疟原虫有四种:
恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale
恶性疟 P.falciparum
● 四种疟原虫中致病力最强 ● 无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治
疗可危及生命 ● 在我国主要流行云南省和海南省
2. 显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视 野（ 300-500红细胞/视野）
3. 按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟 原虫数
4. 如果能见到疟原虫，但是记数5000～10000个红细胞 时却没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
如何确定疟原虫血片为阴性
● 检查全部厚血膜未查见疟原虫 ● 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见
感染红细胞边 缘破碎状
薛氏点明显疟 色素棕黄色,类 似间日疟原虫
种
周 围 血 红细胞形态
疟原虫形态
中发育
阶段
大小
点彩
胞浆
疟色素
裂殖子数
恶 性 疟 原 环状体
虫
配子体
正常
常见 茂氏 点
环状体钎细， 常见２个核
粗黑，配子 体中明显
7疟原虫及虫卵显微镜检查
小滋养体（环状体）
瑞氏或姬氏染色后， 核：红色， 胞浆：兰色， 疟色素：代谢产物呈 棕黄色。
大滋养体
时间：10小时， 胞核：增大 胞质：增多，有空泡 ，有伪足，不规则， 出现细小杆状的疟色 素 红细胞：胀大、变形 ，颜色变淡，出现鲜 红色的薛氏小点。
未成熟裂殖体
时间：40h 胞质：变圆， 无空泡 核:开始分裂。少 于12个。 疟色素:开始集结。
阿米巴滋养体与包囊
蓝氏贾第鞭毛虫-滋养体
蓝氏贾第鞭毛虫—包囊
碘液染色法
物品准备：玻片、棉棒、生理盐水、、滴管、大便 杯、显微镜 检验步骤： 加1滴碘液生理盐水在载玻片。 取米粒大小粪便涂匀，能看清下面字迹。注意去除 粪便渣滓。 高倍镜下镜检，找到包囊后转换油镜镜头观察。镜 检顺序，由上至下，由左至右，不要遗漏。
质量控制
分辩标本采集注意事项 取带有脓血的部位； 盛标本器皿要洁净，防止标本被尿液污染； 考虑到治疗药物的影响，尽量服药前取标本； 快速送检； 标本要保温。
薄血膜制备法
（1）器材：刺血针、载玻片、酒精棉球、干棉球。 （2）试剂：瑞氏或姬氏染液、甲醇。 （3）操作方法： ①取一洁净无油脂的载玻片作载片及一张两端边缘 光滑的玻片作推片备用。 ②以70％酒精棉球消毒病人耳垂，待干后，针刺取 血 ③则用推片取适量血一滴，30～45度角与载片一端 接触后，迅速向前推成一薄膜，推动时注意保持一 定的速度和两片间的角度，切忌过分用力成中间停 顿，否则将使血球破碎或涂片不匀。 ④涂片完毕，将血片臵空气中干燥。
粪便水洗沉淀法
1）仪器：竹筷、40孔钢丝筛、锥形杯、污物缸、载玻 片、温箱 2）操作步骤 ①取30克左右的大便，通过40孔钢丝筛滤入盛满清水的 锥形杯内，残渣倒入污物缸。 ②静止25分钟左左，倒去上层粪水，留下沉淀物，再加 清水至满杯，再静止15～20分钟，倾去上粪水，如此 反复数次，直至上层液澄清为止，倾去上层液，留下 沉淀物。 ③用滴管吸取少量沉淀于载玻片上，在显微镜下寻找虫 卵，常规需查看三张片子。
疟原虫镜检操作规程
疟原虫镜检操作规程疟原虫镜检操作规程1.标本采集1.1标本采集前病人的准备：间日疟及三日疟患者应在发作后数小时至10余小时采血；恶性疟患者，应在发作后20小时左右采血。
1.2标本种类：全血或末梢血。
1.3标本要求：厚血片溶血要及时。
2．标本运送：室温运送。
3．标本拒收标准：被细菌污染。
4．操作步骤 4.1 薄血片法：4.1.1在洁净玻片上，滴血液标本1滴，以常法推制成薄片。
4.1.2 血膜完全干燥后即可用瑞氏法染色，干后用油镜镜检。
4.2厚血片法：4.2.1在洁净玻片上，滴血液标本2滴。
4.2.2用推片将血液由内向外转涂成直径约1cm、厚薄均匀的血膜，在室温中自然干燥。
4.2.3 在干燥的血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血约5分钟后倾去溶血液。
4.2.4 不必待干，进行瑞氏染色，干后镜检。
5．结果判断在油镜下观察，薄片须至少100个视野，厚血片至少20个视野，才能报告“未见疟原虫”；发现虫体后还应在薄血片上进行分类鉴别。
疟原虫胶体金法简易操作步骤原理基于双抗体夹心法工作原理，检测时，滴加5μL全血样本于试剂卡加样孔处，随之滴加4滴裂解液，裂解后的样本在毛细管效应下向上层析。
如样本中含有恶性疟原虫特异性乳酸脱氢酶（pflDH）和疟原虫乳酸脱氢酶（panLDH），将于胶体金标记物panLDH单克隆抗体反应形成复合物，在层析作用下前移，被预先固定在硝酸纤维膜上检测区的pflDH/panLDH单克隆抗体捕获，在检测区内形成1条/2条红色反应线，此时为阳性结果，如样本中无pflDH/panLDH抗原，在检测区内无红色反应线，此时为阴性反应。
步骤1.无菌采集患者EDTA-2K抗凝静脉血2ml。
1. 沿锡箔袋切口，撕开锡箔纸，取出疟原虫抗原检测卡，用铅笔或水写笔编号并做好登记。
2. 吸取5μL全血样本垂直滴加于加样孔A区，同时滴加4滴裂解液于加样孔B区。
3. 15分钟内观察显示结果，超过30分钟无临床意义。
疟原虫血涂片镜检技术规范
附件3疟原虫血涂片镜检技术规范一、吉氏液染色--光学显微镜（油镜）检查同时涂制薄血膜和圆形厚血膜，薄血膜须用甲醇固定，用吉氏染色液（Giemsa stain）进行染色。
吉氏染液用pH7.0-7.2的水配成3%的稀释液，可将血片插入染色缸内染色，或用滴管将稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min，若需快速染色，可在2ml水中加吉氏染液3滴，染色6min 。
对临床诊断为脑型疟者，宜用快速染色法，以便能尽快获得确诊依据。
现症患者至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫才判为阴性。
薄血膜可用于原虫形态鉴定。
以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数，或厚血膜中平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。
染色血片中的原虫核呈红色，胞浆呈兰色。
除环状体外，其他各期均可查见褐色的疟色素。
除恶性疟病例外，均可查见各期疟原虫。
一般恶性疟病例，仅查见环状体，或可见配子体。
但脑型疟病例，不仅原虫密度高，查见的环状体比一般的粗大，而且可查见大滋养体和裂殖体，疟色素呈黑褐色，这些特点对明确诊断很有帮助。
还有一点值得注意，在非洲感染的非重症恶性疟病例，其环状体往往比国内一般恶性疟病例所见的环状体粗大，胞浆较多，与间日疟原虫小滋养体相似，容易误判为间日疟原虫，但也不能同时查见大滋养体和裂殖体，这一点有别于间日疟原虫感染。
二、瑞氏液染色-光学显微镜（油镜）检查同时制作厚、薄血膜，用瑞氏染液（Wright stain）进行染色。
在厚血膜上加清水2-3滴溶去血红蛋白，染色效果较好。
染色时，先在薄血膜上直接加约1ml瑞氏液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上共染5-6min。
其他参见吉氏液染色法。
三、荧光素吖啶橙染色-荧光显微镜检查要求涂制成直径为1.2-1.5cm的亚厚血膜，不宜过薄。
须用甲醇固定薄血膜，用清水溶去厚血膜的血红蛋白。
吖啶橙1g加pH6.5-7.0磷酸缓冲液100ml配制成1%吖啶橙母液。
疟原虫血涂片及形态识别
二、疟原虫各期的形态特点：
间日疟原虫大滋养体
间日疟原虫大滋养体：
薛氏点 疟色素
模式图
返回
实物照片
间日疟原虫早期裂殖体
恶性疟原虫环状体
间日疟原虫成熟裂殖体
间日疟原虫雄配子体
间日疟原虫雌配子体：
模式图
返回
实物照片
间日疟原虫雌配子体
恶性疟原虫雌配子体
恶性疟原虫雄配子体
间日疟原虫环状体
.
一、疟原虫血涂片：
1、薄血膜血涂片：指血膜制备应薄些，其他制备要求 同一般血涂片。涂片在显微镜下红细胞应不重叠，这 有利于观察红细胞内疟原虫一大滴，滴于玻片上，以推片的 一角，将血滴自内向外做螺形摊开，使之成为直径约1cm 大小、厚薄均匀的厚血膜。待厚血膜完全干后，（如再用 火焰固定有助于细胞粘在玻片上），加2-3滴蒸馏水在厚血 膜上使红细胞溶解，待血膜呈灰白色时，去掉血膜上的水， 血膜干后进行瑞氏染色，并在油镜下观察。厚片法疟原虫 的检出率比薄片法高，但由于厚片中疟原虫结构不清楚而 易误认为杂质，环转体也不易观察到，所以对于经验不足 的检验人员来说厚片法也很容易漏诊。
疟原虫的镜检技术
单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-2滴，加中性蒸馏水15-30滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。
较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。
姬氏染液的染色方法
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202X
疟原虫的镜检技术
采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。
疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。
间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。
恶性疟原虫--环状体
环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大 核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫
薄血膜间日疟大滋养体形态
04
02
感染的红细胞：胀大褪色，出现形状大小相等、分布均匀、数目较多、鲜红色的薛氏小点。
虫体大小：较大。
胞浆：不规则，浅蓝色，出现阿米巴伪足，有空泡。
核： 红色，一个。
血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。
发热病人血片
01
标本片
02
血膜的制作（涂片操作）
发热病人血片
涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人， 涂2个厚血膜1个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；
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ICS11.020C62WS 中华人民共和国卫生行业标准WS/T 569—2017疟原虫检测血涂片镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites2017-08-01发布2018-02-01实施前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准起草单位：海南省疾病预防控制中心、江苏省寄生虫病防治研究所、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、云南省寄生虫病防治所、海南省农垦总局医院。
本标准主要起草人：王善青、高琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李雨春、刘莹、欧阳范献。
疟原虫检测血涂片镜检法1 范围本标准规定了血涂片镜检法检测疟原虫的技术规范。
本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1疟原虫Plasmodium spp疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。
寄生于人体的疟原虫主要有恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）等。
2.2血涂片 blood films将血液涂制于载玻片上制成的涂片。
供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。
3 仪器和器材3.1 生物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×目镜）。
3.2 计数器。
3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片）。
3.4 推片。
3.5 血片染色架。
3.6 血片干燥架。
3.7 玻片盒。
3.8 染色盘和染色缸。
4 试剂和材料4.1 吉氏染色原液。
4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。
4.3 甲醇（分析纯）。
4.4 香柏油或专用浸油（折射率≥1.5）。
4.5 二甲苯（分析纯）。
4.6 75%酒精。
4.7 一次性采血针。
4.8 一次性手套。
5 检测步骤5.1 血涂片的制作5.1.1 采血部位及取血方法经75%乙醇消毒采血部位，待干后，用一次性采血针在耳垂或指端扎刺取血，婴儿可从拇趾或足跟扎刺取血。
取1张已消毒推片，用拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液4μL～5μL用于制作厚血膜，再用该端中部刮取血液1μL～1.5μL用于制作薄血膜。
5.1.2 厚血膜制作取1张载玻片，将推片左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径0.8cm～1.0cm 的圆形厚血膜,厚度以1个油镜视野内可见到5个～10个白细胞为宜。
5.1.3 薄血膜制作用干棉球抹净推片左下角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使2张玻片保持25°～35°，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。
每张载玻片上1个厚血膜和1个薄血膜（参见附录A）。
5.1.4 编号血膜制好后水平放置，充分干燥后，用铅笔在玻片一侧毛玻璃上或在薄血膜上编号。
5.2 固定与溶血5.2.1 薄血膜固定将薄血膜一端朝下呈45°，用棉签蘸取甲醇溶液，均匀轻抹于薄血膜表面，避免碰触厚血膜。
5.2.2 厚血膜溶血在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟，待血膜呈浅灰色，倾去溶血液。
厚血膜制作后1d内染色无需溶血，超过1d的应溶血。
5.3 吉氏染色5.3.1 吉氏染液的配制（参见附录B）吉氏染液包括吉氏染液原液和吉氏染液工作液。
吉氏染液原液由5g吉氏粉加250mL甘油充分研磨后加入250mL甲醇配制。
吉氏染液原液在避光条件下可长期保存。
常用的吉氏染液工作液包括2%，3%和10%浓度三种，分别由吉氏染液原液和pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）按比例配制。
吉氏染液工作液只能使用时新鲜配制。
5.3.2 单张血涂片染色（参见附录C）单张血涂片吉氏染色常用于临床疟疾患者的显微镜疟原虫检测。
采用3%吉氏染液的常规染色方法血涂片染色质量较好，可长期保存，染色时间约30min。
采用10%吉氏染液的快速染色方法染色时间较短，8 min ～10min，但血涂片不适合长期保存。
5.3.3 成批血涂片染色（参见附录C）成批血涂片吉氏染色常用于人群流行病学调查中的显微镜疟原虫检测，常采用2%吉氏染液进行批量血涂片染色。
5.4 镜检5.4.1 显微镜检查在染色后的血膜上加1滴香柏油或专用浸油，用100×油浸物镜、5×或10×目镜的光学显微镜检查。
染色质量较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。
除环状体外，其他各期均可查见疟色素。
疟原虫检测以厚血膜为主，虫种鉴别以薄血膜为主。
看片路线顺序为薄血膜从舌尖部分开始，厚血膜从上端或下端开始（参见附录D）。
5.4.2 结果判定5.4.2.1 疟原虫检测阴性厚血膜在油镜下，最少检查100个视野或整个厚血膜未查见疟原虫方可判为阴性。
5.4.2.2 疟原虫检测阳性血膜中查到疟原虫判定为阳性，并根据疟原虫形态(参见附录E)确定恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫或混合感染。
5.4.3 疟原虫的计数5.4.3.1 厚血膜的疟原虫计数法镜检厚血膜，计数每个视野中的疟原虫数和白细胞数，计数200个白细胞以上，疟原虫密度很低时计数1000个。
用下式算出疟原虫密度。
疟原虫数÷白细胞数×每微升血中白细胞数= 疟原虫数／微升血。
如果无法进行白细胞计数，则以8000个白细胞／微升血计算。
5.4.3.2 薄血膜的疟原虫计数法镜检薄血膜，计数每个视野中的疟原虫数和红细胞数，计数1000个红细胞以上。
用下式算出疟原虫密度。
疟原虫数÷红细胞数×每微升血中红细胞数＝疟原虫数／微升血。
如果无法进行红细胞计数，则以男性500万个／微升血、女性按450万个／微升血计算。
薄血膜的疟原虫计数法适用于疟原虫密度很高时（每微升血中疟原虫数>16000个）的疟原虫计数。
5.5 血涂片保存用吸水纸吸去已检血涂片血膜表面的香柏油或专用浸油，在血膜上滴加2滴～3滴二甲苯，然后用吸水纸吸干（专用浸油无需用二甲苯清洗，可直接用吸水纸吸干）。
置血涂片于玻片盒内，避光、干燥和阴凉保存，以备复核。
附录 A（资料性附录）厚血膜和薄血膜血涂片制作示意图厚血膜和薄血膜血涂片制作示意图见图A.1。
图A.1厚血膜和薄血膜血涂片制作示意图附录 B（资料性附录）吉氏染液的配制B.1 吉氏染色原液配制吉氏粉5.0g，甲醇250mL，甘油250mL。
将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500mL有塞深色玻璃瓶中。
在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵中甘油为止。
塞紧瓶塞，置室温内，每天用力摇动溶液5min，3d后即可使用。
注意事项：将瓶塞塞紧，以避免蒸发和高湿造成的氧化；储存在深色的玻璃瓶中，避免阳光直射，储存时间越久染色效果越佳。
根据日常的需求，用干燥吸管吸取少量的染色原液到密闭的分装瓶中（大约25mL）。
切勿向原液中加入水。
B.2 pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制先制备好两种贮备溶液。
溶液I为9.5g无水磷酸氢二钠加蒸馏水至1000mL，溶液II为9.07g磷酸二氢钾加蒸馏水至1000 mL。
制备时将磷酸盐置于容量瓶中，加入部分蒸馏水摇匀使溶解后，再加入蒸馏水稀释至1000 mL，充分摇匀，塞紧备用。
临用时，取73 mL溶液I和27 mL溶液II，倒入1000 mL容量瓶中，加入部分蒸馏水，混合摇匀后，再加入蒸馏水稀释至1000mL的刻度，塞紧瓶塞反复摇匀后，即配制成pH7.2的缓冲溶液。
B.3 吉氏染色工作液的配制B.3.1 3%吉氏染色工作液的配制在97mLpH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入3 mL吉氏染色原液并混匀。
B.3.2 10%吉氏染色工作液的配制在9mLpH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入1 mL吉氏染色原液并混匀。
B.3.3 2%吉氏染色工作液的配制在98mLpH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入2 mL吉氏染色原液并混匀。
B.3.4 注意事项吸取吉氏染色原液时切勿摇晃盛染色原液瓶子。
吉氏染色工作液应现用现配，切勿将未用完的吉氏染色工作液倒回原液瓶中。
附录 C（资料性附录）染色方法C.1 单张血涂片染色法C.1.1 3%吉氏染液染色法C.1.1.1 把薄血膜经甲醇固定的血涂片血膜朝上水平放置在染色盘中。
C.1.1.2 用吸管吸取新配制的3%吉氏染液约3mL，滴加于厚、薄血膜上，至染液均匀覆盖血膜但不溢出为止。
C.1.1.3 静置染色约30min。
C.1.1.4 将染色盘移至冲水池，用缓慢流水沿血涂片上缘冲洗约1min。
C.1.2 10%吉氏染液快速染色法C.1.2.1 把薄血膜经甲醇固定的血涂片血膜朝上水平放置在染色盘上。
C.1.2.2 用吸管吸取新配制的10%吉氏染液约3mL，滴加于厚、薄血膜上，至染液均匀覆盖血膜但不溢出为止。
C.1.2.3 静置染色约8 min～10 min。
C.1.2.4 将染色盘移至冲水池，沿血涂片上缘用缓慢流水冲洗约1 min。
C.1.2.5 将染色后的血涂片血膜朝下插入血片干燥架，晾干。
C.2 成批血涂片染色法C.2.1 将每张血涂片的血膜朝一个方向插入染色缸中，或将血涂片血膜朝外成对插入染色缸中。
C.2.2 倒入新配制的2％吉氏染液浸没厚、薄血膜。
C.2.3 静置染色约30 min。
C.2.4 向染色缸中注入自来水或PBS缓冲液至溢出，除去染液表面浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，缓慢冲洗2次～3次。
C.2.5 取出血涂片，血膜朝下插入血片干燥架，晾干。
C.3 注意事项染色后不要直接将染液倒掉，应将血涂片连同染液一起放在水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水，使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒玷污血膜。
成批染色时,不要将染液直接倒到厚血膜上，以免将厚血膜冲掉。
染色时间除染液浓度外,还与染色时的温度有关, 成批染色时，应先进行单张血涂片试染，以确定最佳染色时间。
附录 D（资料性附录）看片路线顺序示意图看片路线顺序示意图见图D.1。
图D.1 看片路线顺序示意图附录 E（资料性附录）四种疟原虫薄、厚血膜形态(吉氏染色) E.1 恶性疟原虫薄厚血膜形态图见图E.1。
图E.1 恶性疟原虫薄厚血膜形态图E.2 间日疟原虫薄、厚血膜形态图见图E.2。
图E.2 间日疟原虫薄、厚血膜形态图E.3 三日疟原虫薄、厚血膜形态图见图E.3。