疟原虫血片制作染色

制作厚血膜
制作薄血膜
厚血膜血量及涂片法
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4~5微升血 量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触， 再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径 0.8~1厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易 于脱落，过薄达不到检出率的要求。
2019/10/29
7
薄血膜血量及涂片法
2019/10/29
11
制作血膜的注意事项
2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内或者 实验台面上。厚血膜未干前勿使标本片倾 斜，以免未干的血膜倾向一侧，造成血膜 厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检 查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍 蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装 入标本盒内。新木制标本盒需敞开放置一 段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚 血膜血红蛋白被其固定，不能溶血或染色 效果不佳。
2019/10/29
23
影响染色效果的因素
（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着 色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛 氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度 过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不 明显或消失。
2019/10/29
24
影响染色效果的因素
（5）染色时间 染色时间长染色效果好， 反之较差。室温高则着色快，染色时间可 略缩短，气温低可适当延长。因此染色时 间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和 气温而适当增减。
伊红在水溶液内遇到美兰或天青，即可互相化合而产生沉 淀从而失去染色力，因此，吉氏染液的母液绝对不能进水。
2019/10/29
17
血片的染色
（二）吉氏染液母液配置方法
取吉氏粉0.5克置于研钵中，
加少量甘油充分研磨，再加再磨，
至25毫升加完为止，倒入60或 100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。
材料：
在研钵中加少量甲醇，洗去甘油 1、吉氏粉0.5克
2019/10/29
9
血片编号
血膜制成后，立即将受检者的个人编 号写在玻片磨砂面上（血片的编号要 与血检登记本上编号一致）以防差错。
2019/10/29
10
制作血膜的注意事项
1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、 磨损。制作血膜的载玻片必须完 全清洁而毫无油渍或污垢。制片 时，手指只能持载片的边缘，不 能接触玻片表面，以免油污使薄 血膜产生空白区以及厚血膜脱落。 作为推片的玻片边缘一定要平滑， 才能使推出的血膜均匀一致。
2019/10/29
20
影响染色效果的因素
血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片 制作质量好坏等有关外，还受到以下几个 因素的影响：
（1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油 如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而 影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇 和中性甘油，而且在配制时所用的器具必 须干净而无水份。
血膜干燥后，用甲醇或无水酒精固定薄血膜，用过滤 清水或自来水对厚血膜溶血，然后再进行染色。
成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染 色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性 蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染 色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时 间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲 洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干 板上，待干镜检。
Whatman(沃特曼)903号；将滤纸切成 10*2cm大小的纸片，以口径为1.2cm的大孔 管，在滤纸上压出两个圆形印迹备用。
载玻片的清洗
载玻片 用以涂制血膜的载玻片，必须清洁无油迹。 有油迹的载玻片涂制的厚血膜容易脱落，薄血膜涂 不均匀。
新玻片处理 应浸于有液态洗涤剂清水中10~20分 钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净， 晾干后用干净柔软的棉巾擦亮备用。也可以95%的 乙醇浸泡5~10分钟，再用纱布擦干擦亮备用。
略多或略少
过多或过少
薄血 膜
位置 直径 外观
玻片1/2～1/3处
2.0～2.5cm
舌状厚薄均匀， 无划痕
稍偏右或偏左 稍大或稍小 舌状稍不均
偏右或偏左过多 过多或过少 厚薄不匀呈波浪型，有划痕
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染色原理：伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性 水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离 解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸 性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质如血红蛋白、 嗜伊红白血球颗粒等即可结合成不易溶于水的 沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的美兰 离子，美兰就与疟原虫、淋巴和大单核细胞的 胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合 染成兰色。
2019/10/29
26
影响染色效果的因素
（7）染色后不要直接将染液残渣倒掉，应 沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢 出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污染 片血膜。
2019/10/29
27
配制pH6.6~7.4缓冲液两种贮备液用量表
溶液Ⅰ
溶液Ⅱ
pH
ml
磷酸氢二钠含
ml
磷酸二氢钾含
量(g)
染液混入瓶内，至25毫升甲醇 洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶
2、甘油25毫升
塞，充分摇匀，置于55~60℃ 3、甲醇25毫升
水浴中或温箱内24小时或室温
内3~5天，多加摇动，即成原
液。吉氏染液是目前较优良的血
膜染剂，即使在炎热天气中，亦
可经久不变。
2019/10/29
18
血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法
旧玻片处理 用过的玻片浸泡洗涤剂溶液中1~2天 或者浸泡于煮沸好的5%肥皂水中1~2小时，逐个 擦去玻片上的旧血膜痕迹，用清水漂洗干净擦干擦 亮。
洗净载玻片处理 每10~20张用白纸包好或者装原
玻片盒里再放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。
2019/10/29
3
取血部位及方法
取血部位及方法 取血部位以耳垂较为合 适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾 或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取 血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血 部位1~2毫米深，然后用左手大拇指、食 指和右手中指协同挤出血滴。
2019/10/29
16
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
注意：蛋白质是二性电解质，当其处于较等电点为酸的溶液中时， 便呈碱的作用，即与酸或阴离子结合，这就说明为何在染液偏 酸时，伊红的着色力强，使红细胞着色鲜艳而淋巴细胞和原虫 的胞浆着色不显著；反之，蛋白质在偏碱的溶液中呈酸的作用 而中和碱基，也就说明为何染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细 胞的颗粒等被染成紫兰色。
恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小 时内取血，初发患者退热后常查不到疟原虫。
2019/10/29
5
涂制血膜规则
用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈 薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘状，称厚血膜。
薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。 涂片顺序，先厚后薄；位置分配，血片自左向右：薄厚-标签；推薄片用玻片短边。
血片制作和染色质量标准
项目
检查 内容
好
质量标准
中
差
血量 4～5ц l
略多或略少
过多或过少
厚血 膜
位置 直径
玻片右1/3 0.8～1.0cm
稍偏右
0.7～0.8 或1.0～ 1.2cm
偏右过多 <0.7或>1.2cm
血片 制作
外观 血量
圆形厚膜均匀， 边缘整齐
1～1.5ц l
圆形稍不均不整齐 厚薄不匀影响着色
2019/10/29
13
血片的染色
（一）染液的种类及染色原理
染液种类：目前所用的血片染色液，虽然名称 很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的染液 变化过来的。总的可分为水溶液和酒精溶液 两大类，前者包括罗氏、西氏（Simon)、 J.S.B氏染液等，后者包括利氏 (Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被国家推 荐使用）等。这些染液中的主要染剂都包含 美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青，所以 称为多色性染剂。
2019/10/29
19
血片的染色 （三）吉氏染液血片染色方法
单张血片染色：薄血膜经甲醇固定干燥后，用 2%吉氏染液稀释液1~2毫升，滴入血片标 本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水1~2 毫升，加吉氏母液1~2滴，混合均匀后滴入 血片标本上，染色20~30分钟，然后用清水 轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。
2019/10/29
21
影响染色效果的因素
（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚 未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。 染液存放时间越久，染色力越强。通常在 染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶 子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。
2019/10/29
22
影响染色效果的因素
（3）染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染 液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化 产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解， 但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生 沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用， 一般在半小时内染色力最强。
2019/10/29
25
影响染色效果的因素
（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用 水应选择Ph7.0~7.2清洁水，通常使用的新鲜 的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、 河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓 冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱） 或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水 冲洗血片予以纠正。
薄血膜 取洁净的载玻片2张， 1张平置在桌上，以左手拇 指，食指夹持载玻片两端 （手指切勿接触玻片表面）， 用另一张边缘平滑（最好为 磨口边缘）的载玻片做推片， 用推片一端边缘的中点从取 血部分刮取约1~1.5微升的 血量（相当于1/4火柴头大 小），使血滴与平置的载玻 片接触，并形成25~35度 夹角，待血液向两侧扩展约 2厘米宽度时，均匀而迅速 地轻轻向左推出（约2.5厘 米长）且边缘带有“舌状” 的薄血膜。
2019/10/29
15
血片的染色 （一）染液的种类及染色原理
染色原理：美兰与伊红都不能使原虫和白细胞 的核着色，必须由天青作为媒介（染媒）才 能使其着色。天青虽然也是碱性染剂，但又 具有染媒作用，使原虫核和白细胞核等原来 只能染上极淡兰色的结构染上显著的酸性染 剂伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显 著的既兰又红的紫兰色，而较小或菲薄的原 虫核和淋巴细胞原浆中的颗粒染成紫红色。
2019/10/29
8
涂制厚、薄血膜的位置
通常是将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法 是将载玻片分为3等分（留出标签或磨砂面位 置后的3等分）。厚血膜涂在载玻片靠近标签 或磨砂面方向的右1/3中央处，圆形、厚薄均 匀 、 边 缘 整 齐 。 薄 血 膜 涂 在 载 玻 片 1/2 至 左 1/3的中部位置，舌状、厚薄均匀。
2019/10/29
12
制作血膜的注意事项
3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤， 干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可 能24~48小时内固定染色；冬天也不能超过 72小时。放置时间越久，厚血膜越不易溶血， 染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先 用甲醇固定（1~3分钟）然后用过滤清水或自 来水对厚血膜溶血，晾干后包好置干燥器于冰 箱内保存，用时将干燥器置室温中1~2小时后 取出染色。
疟原虫血片制作及染色技术
湖北省疾病预防控制中心
2019/10/29
1
血片制作所需设备
载玻片 具有磨砂面，且规格是玻片宽度乘长度在 25.2*75.2mm，厚度1mm~1.2mm为好。
推玻片 有专用的。但现在一般选择边缘光滑整齐的载玻 片替代推玻片。
采血针 使用一次性的采血针。 玻片盒 木制/塑料均可以。 75%酒精棉球 用于采血部位的消毒。 记号笔/B2铅笔 用于载玻片上编写号码。
2019/10/29
4
采血时间
取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普 查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期 疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。
间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环 状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体 期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断疟疾 的有利时机；36~48小时，可检出裂殖体； 发作一、二次后，配子体出现较多。
量(g)
6.6
54.7
0.52
148.8
1.35
6.8
68.4
0.65
126.8
1.15
7
89.5
0.85
99.2
0.9
7.1
96.8
0.92
88.2
0.8
7.2
105
1
77.2
0.7
7.4
126.3
1.2
55.1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0.5
注：用于薄血膜的染色和一般漂洗时，用蒸馏水稀释至1 000ml，用于厚血膜 及同一张玻片上厚血膜与薄血膜的染色时，用蒸馏水稀释至500ml。