抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；
（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；
同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD总活性＝[( A ck-A E )×V]/（1/2A ck×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；
A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS 的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。

二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml 混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制（以60个样为准）：
取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）样品测定：
取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。

（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

2、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。

（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。

（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。

（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。

CA T=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。

四、超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）
1、试剂的配制
（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；
（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；
（3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。

2、O2.-含量的测定
（1）样品液提取方法同SOD测定；
（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。

（3）在25℃下保温1小时；
（4）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM α-萘胺，混合后快速摇匀；
（5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；
（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；
（7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]；根据羟胺与O2.-的反应式：NH2OH＋2O2.-＋H+NO2-＋H2O2＋H2O 计算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再
根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鲜重表示）。

O2.-产生速率=（C×V）/（t×W）（nmol min-1g-1鲜重）
C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)
参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，1990，（6）：55～57
五、丙二醛含量的测定
1、试剂配制：
10%TCA：100g 三氯乙酸→ 1L
0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸→ 500ml 10%TCA （避光）
2、测定步骤:
0.2 样品+1.6ml 10%TCA 研磨→12000g 离心 10min →上清1.5ml +1.5 0.67% TBA →沸水煮30min →冷却，离心→上清OD450，OD532，OD600
3、计算组织中MDA含量：
MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450
MDA含量(umol/g FW)=C×V/W
式中V为提取液体积(1.6ml)，W为样品鲜重(0.2g)。

六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）
（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；
（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；
（3）再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；
（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：
相对电导率（%）=R1/R2×100%
还可以计算植株伤害程度：
伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100%
七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）
1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。

在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温
下可在暗中保存一个月。

（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml 标准BSA溶液）。

2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。

（2）蛋白质含量计算：
可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×V T)/(W×V S×1000)
C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；V T为提取液总体积（稀释后的体积ml）；V S 为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。