淀粉酶产生菌的分离
产淀粉酶菌株的分离与提纯
产淀粉酶菌株的分离与提纯摘要：淀粉酶是一种广泛应用于食品、饲料和生物能源领域的酶类。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过营养物质筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
分离出的菌株经过形态学、生化和分子生物学鉴定，最终确定为放线菌属。
通过筛选和优化培养基组成、培养条件、发酵时间等参数，获得了产淀粉酶的高产菌株，其中最高淀粉酶活性达到406.2 U/mL。
随后通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化，纯化后的淀粉酶总回收率为78.5%。
本研究拓展了淀粉酶菌株的来源渠道，并提供了一种有效的产淀粉酶筛选和提纯技术。
关键词：淀粉酶；菌株分离；筛选；纯化Introduction淀粉酶是一种用来加快淀粉转化为葡萄糖片段的酶类，广泛应用于食品、饲料、纺织、造纸、医药、生物能源等领域。
因此，发现新的产淀粉酶的菌株和提高淀粉酶的产量和纯化度具有很大的应用前景和经济价值。
本研究旨在从土壤样品中分离出产淀粉酶的菌株，并通过筛选和鉴定，最终获得高活性的产淀粉酶菌株。
随后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析和手性分离层析等技术，对产淀粉酶菌株进行了纯化。
Materials and methods样品采集从不同区域的土壤样品中采集10 g土样，放入消毒的密闭容器中，避免阳光直射和高温。
待采集完毕后立即运回实验室处理。
淀粉酶活性测定淀粉酶活性采用Miller方法测定，在37℃下反应15 min后，以0.01mol/L NaOH终止反应，读取吸收度A450。
反应体系为：淀粉溶液 1 mL、哌嗪酸盐缓冲液1 mL、酶液1 mL。
菌株分离取0.1 g土样加入0.9mL 生理盐水中，混合搅拌均匀后，依次向1.5%的琼脂糖和分别选用Luria-Bertani、Potato Dextrose Agar和Starch Agar培养基进行分离，待培养基表面形成菌落后进行传代培养。
通过形态学、生化和分子生物学鉴定，确定产淀粉酶菌株。
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选
生物技术综合实验——淀粉酶产生菌的初步筛选一、实验目的学习从自然界中筛选分离淀粉酶产生菌株。
二、实验内容淀粉酶产生菌的筛选和分离。
三、实验原理在筛选培养基平板上，可溶性淀粉被目的菌株产生的淀粉酶水解，形成透明圈。
不同种类的微生物产生的淀粉酶的种类和活力各不相同，对可溶性淀粉的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对可溶性淀粉的水解能力。
许多细菌和霉菌产生淀粉酶，特别是一些芽孢杆菌，因此，本实验将土壤样品加热处理后，将其接种到筛选培养基平板进行培养，根据平板的水解圈做初筛，从中筛选出产淀粉酶活性较好的菌株进行保藏。
四、实验材料和用具1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨筛选培养基平板（含可溶性淀粉1%）、45mL无菌水瓶3、仪器及用具：恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、酒精灯、牙签、移液枪、试管、涂布器、量筒等。
五、操作步骤（一）准备材料1、筛选固体培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入可溶性淀粉（1%），配制600mL，制备30个平板。
2、含45mL水的三角瓶5瓶，200ul枪头及枪头盒3盒，牙签3瓶，涂布器3包，灭菌处理。
（二）菌种分离1、土壤采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，首先去除地表浮土，然后挖取2-5cm深的土壤样品，每个样品约取20g土壤，装入塑料袋内，备用。
2、制备菌悬液取5g土壤样品置于含45ml无菌水的三角瓶中，用振荡器震荡10分钟，在90度水浴锅中处理15分钟。
3、涂布平板培养与分离吸取100ul悬浮液，用涂布器涂布于筛选培养基平板，待液体充分被吸收后，置于37℃培养箱中培养48h。
每组做2个平板。
（三）菌种初步筛选在平板中加入少量卢戈氏碘液，观察菌落形成透明水解圈情况，用无菌牙签挑取产水解圈的菌落，转接到新的筛选培养基中，每个平板上接种16个菌种，每组接种2个平板，置于37℃培养24h。
在平板内加入卢戈氏碘液，根据单菌落透明圈直径与菌落直径比值(H/C)大小进行初筛，选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌株，从中选取淀粉酶活力相对较高的菌株。
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
淀粉酶产生菌的筛选实验小结
本实验旨在筛选具有淀粉酶活性的菌株，经过活性药物筛选法，通
过对新鲜海藻类源淀粉酶活性药敏试验结果，用神经酰胺蓝显色法共
分离出了12株具有淀粉酶生成活性的菌株，且12株菌株的淀粉酶活
性均明显优于对照组的淀粉酶活性。
经过16s rDNA分析，结果表明，
这12株菌株属于嗜热及高温嗜热乳杆菌科，包括拟南芥病毒乳杆菌属、干燥乳杆菌属，伯氏乳杆菌属、钝吸乳杆菌属等。
以上结果表明，该
方法高效可靠，可以用于筛选具有淀粉酶活性的微生物菌株，为药物
的开发和应用提供了重要的理论支持。
细菌α淀粉酶产生菌种筛选
1、采样：即采集含菌的样品
1）研究所筛选的微生物得可能分布区域。 2）土壤是微生物的大本营，所以一般采集土样。 3）土壤中，数量上细菌>放线菌>霉菌>酵母菌。 4) 不同区域的土壤含有相应的优势微生物。例如
树林腐土和朽木中纤维素分解菌较多；面粉厂附 近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌较多； 果实、树叶表面酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸 菌较多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌 较多等。
2、培养基
1）分离培养基（w/v）：蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；牛肉膏 0.5%；可溶性淀粉 0.2%；琼脂1.5%；pH7.2；水定容。 注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到 溶化好的培养基中，调匀。
2）肉膏蛋白胨培养基（w/v）：肉膏蛋白胨培养基：牛 肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%, pH7.07.2
最常用的分离方法是稀释分离法。
4、性能测定
分离得到纯种只是选种工作的第一 步。所分离的纯种是否具有生产上要求 的优良性能，还必须进行性能测定，根 据性能高低进行取舍。
性能测定的方法
1）初筛：一般在培养皿上根据选择性培养基 的原理进行。 例如要筛选淀粉酶产生菌，可以在稀释 分离时使用选择培养基——含淀粉的培养基， 经培养后通过测定透明圈与菌落直径的比 值来衡量淀粉酶活力的高低。
五．实验报告
总结整个分离筛选过程，写出筛 选结果并对筛选结果进行分析。
六. 实验时间安排
周一：配制培养基并灭菌、配制试剂；稀 释分离，37℃培养24h。
周二：碘液检查，挑取透明圈直径：菌落 直径比值大的单菌落，平板划线，37℃ 培养24h。
周三：挑取单菌落接斜面培养基。 周四：接麸曲培养基，37℃培养24h。 周五：测定酶活。
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定生物11.1魏凡棣 37实验目的：对可产生淀粉酶的芽孢杆菌进行分离的测定实验原理：1.传代培养：从土壤中提取微生物，经过一段时间的培养就会大量滋生形成菌落，不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态构造上也有许多明显的反应，而为了保存某种已经获得的菌株，一般采用低温（4摄氏度）抑制微生物的生长，使其保留活性。
2.细胞染色：微生物细胞在碱性，中性及弱酸性溶液中通常带负电，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
而革兰氏染色则首先用草酸铵结晶紫进行初染，使所有细菌都着结晶紫的蓝紫色；后用卢戈氏碘液媒染增强染料在菌体中滞留能力；后用95%乙醇脱色，由于细胞构造不同革兰氏阴性细菌中碘—结晶紫易洗脱，而经过复染后又被番红染成红色。
3.在显微镜下测定芽孢杆菌的大小：目镜测微尺是一块可放入接目镜内圆形小玻片。
有精准刻度，使用时放入接目镜中隔板上，用以测量经放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，其代表实际长度也不同。
因此，使用前必须校正，以求出在该倍数下每小格所代表的相对长度，后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞实际大小4.芽孢杆菌对淀粉的水解：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质水解才能被吸收利用。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精双糖和单糖。
5.温度对芽孢杆菌生长影响的测定：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。
而不同类型的微生物对温度的适应能力也有所差别。
实验器材：高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨 NaCl 蒸馏水土样试管培养皿移液管涂布器酒精灯显微镜革兰氏染液载玻片显微镜测微尺二甲苯擦镜纸淀粉‘实验步骤：一、芽孢杆菌的分离纯化：1.取合适量的牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水按一定比例配成牛肉膏蛋白胨培养基。
调整PH至7.4到7.6。
产淀粉酶细菌菌株分离
淀粉酶芽抱杆菌的筛1目的了解产淀粉酶细菌的分离和纯化的原理，掌握常用的微生物分离、纯化方法2原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
3材料Q A严去甘3.1培养基淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、氯化钠0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% 。
3.2 溶液或试剂盛9ml 无菌水的试管，盛99ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶, 制霉菌素母液（抑制真菌）。
3.3 样品土样3.4 仪器或其它用具高压蒸汽灭菌锅、旋涡混合器、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、恒温水浴装置等。
4实验流程倒平板f制备梯度稀释液f涂布（或倾注法）f培养f挑单菌落f保存。
5步骤准备工作：摆好实验材料：将培养基、接种工具和其它用品全部在超净工作台上摆好。
进行紫外线灭菌30min,关闭紫外灯，20-30min后打开照明灯，进行操作。
接种前用酒精棉球将双手消毒。
5.1 稀释平板法①倒平板将淀粉培养基加热溶化待冷至55〜60C时，混合均匀后分别倒平板，淀粉培养基倒六皿三皿用于稀释平板；三皿用于划线分离。
_淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育
Animal Husbandry and Feed Science
2010 ，31 （9 ）:1-3
α- 淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育
刘雅琴，陈海魁，孔令全 （北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021）
摘要：从土样、水样和面样中分离产 α-淀粉酶的芽胞杆菌，对 3 个样品进行淀粉平板分离和革兰氏染色 、芽胞染色，选
①土样照片
第9期
刘 雅 琴 等 ：α-淀 粉 酶 产 生 菌 的 分 离 筛 选 与 诱 变 选 育
3
③面样：菌落与土样、水样基本类似，只是在菌落中心 有蜡样圆心小斑。 2.2 产 α-淀粉酶菌株的筛选结果 土样、水样和面样 3 个 样品中分离出产淀粉酶的芽胞杆菌， 利用淀粉平板共分离 出 64 株单菌落，经稀碘液染色有水解圈且显微镜下观察和 芽胞染色后， 选出具有产淀粉酶能力的芽胞杆菌 47 株，筛 选 出 有 较 大水 解 圈 的 10 株 ， 其 中 ， 土 样 4 株 （菌 株 编 号 Ty1~Ty4）、面样 3 株（菌株编号 My1~My3）和水样 3 株（菌株 编号 Sy1~Sy3）。 10 株菌的菌圈比（即 HC 比值）见表 1。
外酸性淀粉酶还可应用于青贮饲料发酵饮料废液的处理等多种领域近年来我国酶制剂工业蓬勃发展品种和产量也不断增加但是同国外酶制剂行业相比尚有一定的差距我国淀粉酶剂型品种和生产菌株都很单一由于我国淀粉资源丰富淀粉酶应用范围广泛淀粉酶工业发展也必将促进我国其他工业的迅速发展为了适应经济发展的需要应进一步扩大淀粉酶的产量和品种通过对淀粉酶生产菌进行分离筛选将有助于发现因此该研究从富含淀粉的地方采集面样土样水样进行试验以期获得在某些方面性能优良如耐高温耐强酸耐强碱等的粉酶生产菌从而为将来改良淀粉酶生产菌以及满足不同行业的需要奠定理论基础材料与方法11培养基和菌种淀粉培养基g可溶性淀粉mpa灭菌min产淀粉酶发酵培养基
产淀粉酶菌株的分离和筛选
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
淀粉酶产生菌株细菌的分离纯化及检测
1%豆粕粉浸出液的制备
称取1%豆粕粉，加入适量水； 加热煮沸20min，过滤后定溶至1Hale Waihona Puke 的体 积备用； 加热过程注意补水。
实验中器材的准备（需要包扎灭菌）
1ml无菌吸管 6支 99ml无菌水 1瓶（带玻珠，装于 250ml三角瓶中） 9ml无菌水 4支（装于18×180mm试 管） 不锈钢涂布器 3支
实验步骤及安排
今天完成稀释平板分离培养——倒平板、 样品稀释、加样、涂布、恒温倒置培养 （37℃ 48hr）； 2天后晚上，挑菌保存，点植平板培养 24hr； 点植后24hr内检测淀粉酶产生量——测量 平板上透明圈、菌落直径，并计算出比值。
实验结果
记录稀释平板分离的结果——细菌数、产 淀粉的菌数及所点比例； 记录点植结果——挑取菌株编号、透明圈 直径、菌落直径，并计算出透明圈、菌落 直径比； 根据以上结果完成实验报告； 确定相关菌株（5~10株）保存好，准备 进行下周摇瓶初筛试验。
目的要求
了解利用选择培养基进行α-淀粉酶产生菌 株分离的要求。 掌握α-淀粉酶产生菌株相关分离纯化的方 法步骤——稀释平板菌落分离、挑菌保存、 平板点植、观察测定透明圈等。 学习在平板上进行α-淀粉酶产生菌株的检 测及产酶高低的判断。
平板分离用选择培养基
可溶性淀粉 10g； 1%豆粕粉浸出液 1000mL； Na2HPO4 .12H2O 2g； （NH4）2SO4 1g； CaCl2 0.5g； KCl 0.15g； 琼脂 20g pH 7.0~7.6 121.3℃灭菌20分钟
土壤中产淀粉酶菌株分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
淀粉酶产生菌的分离
7
2(2.0 %) 1
0 1
1
01
酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要 求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相
应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。
02
酶活力测定： 酶活力以每毫升粗酶液在40摄氏度，
pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。
淀粉产生菌的筛选：
演讲完毕，感谢观看
酶活力测定：
选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培 养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中， 吸取此培养液加入淀粉培养液中， 30摄氏度摇瓶培养72h。
酶液稀释： 取发酵液进行 4000r/min离心5min，取上清液， 用缓冲液适当稀释。
标准曲线制作： 准备七支试管，按照下 表配置混合液。使用分光光度计策规定 各管溶液在660nm下的OD值。然后以 淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标， 做标准曲线。
管号
1
2
3
4
5
6
淀粉稀释液/ml
2(0 %)
2(0.2 %)
2(0.5 %)
2(1.0 %)
2(1.5 %)
2(2.0 %)
缓冲液/ml
1
1
1
1
1
1
40摄氏度水浴保温5min
蒸馏水/ml
1
1
1
1
1
粗酶液/ml
0
0
0
0
0
0
40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min
稀碘液/ml
1
1
1
1
1
1
0 种产淀粉的能力。
2
实验器材料及试剂： 材料：河南科技学院花园土壤。 培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏 3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中， 再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min， 待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝 酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸 镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调 整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
Admin [选取日期]土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验目的1、掌握从土壤中分离产淀粉酶菌株的方法2、掌握平板法分离与纯化微生物的技术3、进一步熟练和掌握无菌操作技术二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
分离得到的单个菌落还要进行性能的筛选,分为初选和复选.三、实验材料样品:张掖市甘州区青松村面粉厂周围采集的土样若干试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱 .移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等液体培养基:淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L四.实验步骤(一)培养基的配置1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，应控制火力并需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计一、实验目的1. 学习进行微生物的分离纯化技术；2. 了解产淀粉酶菌的特性及其分布情况；3. 掌握酶活性的测定方法。
二、实验原理1. 淀粉酶的作用原理：淀粉酶是一种酶，能够分解淀粉为糖类，在微生物领域中，主要用来测定产淀粉酶菌的酶活性。
2. 微生物的分离纯化：通过微生物分离鉴定方法可以筛选出产淀粉酶菌，并进行分离纯化，其中包括表面接种法、液体菌种鉴定法等。
三、实验步骤1. 采样：采取合适的方法选择样品进行采取，如土壤样品、水样、废弃物等；2. 培养：将采取的样品进行接种并培养于适宜的菌种培养基中，环境条件应符合产淀粉酶菌的生长需求；3. 分离：通过常规分离方法进行分离，如表面接种法，可将菌落形态清晰的约8-10个菌落分别转移到其它培养基上，进行单菌落质量检查，然后进行挑选；4. 鉴定：对于产淀粉酶菌的鉴定有多种方式，如细菌形态、生理生化反应等；5. 纯化：将鉴定出的产淀粉酶菌进行分离纯化，可采用多种方法，如悬浮液稀释、柠檬酸-NaOH柱层析，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
四、实验注意事项1. 实验操作要严格遵守微生物的安全操作规范；2. 实验过程中要严格控制温度、湿度等环境条件，以保证产淀粉酶菌的正常生长；3. 实验设备、试剂应做好消毒处理；4. 对实验中出现的不明菌落应及时进行鉴定和处理；5. 实验后要做好设备及消毒剂的清洗工作。
五、实验结果分析1. 产淀粉酶菌分离纯化后可进行酶活性测定，得出具体的酶活性值；2. 酶活性值与产淀粉酶菌的菌种、产生淀粉酶的量等因素相关；3. 实验结果可反映出产淀粉酶菌的分布情况及其产酶的峰值期等信息。
六、实验拓展1. 可通过实验数据，筛选产酶量高的淀粉酶菌进行进一步研究开发；2. 可实验条件、测定方法等进行改进，提高产淀粉酶菌的分离纯化效率及酶活性测定准确度。
七、实验结论通过对产淀粉酶菌的分离纯化和酶活性测定，可以研究淀粉酶的特性及其在工业、农业等方面的应用，为淀粉酶的开发应用提供物质基础。
土壤中产淀粉酶菌株的分离与鉴定及高活力淀粉酶的筛选
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选组数：第一组组员：王臣东李长花张晓晶杨明明1 实验目的1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。
1.3掌握分离纯化微生物的方法。
1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
1.5巩固以前学的微生物学实验技术。
1.6学习淀粉酶活性的测定方法。
2 实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
淀粉酶是能够催化淀粉水解，转化成葡萄糖的、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称。
从淀粉厂周围采集土壤样品，采用稀释法制备土壤稀释液，涂布于营养琼脂培养基平板上培养1天，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。
然后挑取可产生透明圈的菌株在平板划线培养2-3次，得到纯化的菌株，再测其酶活力大小。
分离得到纯种这只是选种工作的第一步。
所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
性能测定的方法分初筛和复筛两种。
初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。
例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。
复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。
一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。
在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。
3 实验器材3.1样品：土样（甘肃昆仑生化公司周围采集的土样若干）3.2培养基3.2.1平板培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、琼脂15-20g、自来水1000ml3.2.2斜面培养基：同3.2.13.2.3液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、自来水1000ml3.3 器材：30个90培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台3.4试剂3.4.1 淀粉酶活力测定：碘液3.4.2革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇3.4.3 2%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml4 实验步骤4.1 培养基的制备及其仪器的灭菌4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
细菌产淀粉酶菌种分离与分子鉴定
细菌产淀粉菌种分离与分子鉴定摘要：淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，具有重要的经济利用价值。
本实验意在筛选产淀粉酶菌种，并进行16S rDNA的分子鉴定。
通过分离纯化rRNA进行测序，最终在数据库中查找确定所属类别。
关键字：枯草芽孢杆菌；rRNA；PCR法；序列测定1 引言土壤中含有各种微生物，其中包含淀粉酶的枯草芽孢杆菌。
在淀粉作为唯一碳源的鉴别培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体才能成为优势菌种。
在含淀粉作为唯一碳源的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，若菌落周围能形成淀粉水解圈，表明该菌具有产淀粉酶的能力。
对于淀粉酶产生菌的筛选分析，强调注意微生物的安全性，防止筛选到一些对人体有害的病原微生物。
细菌中的核糖体RNA分为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,其中16S rRNA相对分子质量适中。
16S rDNA由可变区和恒定区组成，不同细菌的恒定区序列基本保守，而可变区序列因细菌而异，故可利用恒定区的序列设计引物将16S rDNA扩增出来，利用可变区序列的差异对不同的细菌进行分类。
本文旨在筛选自然界中存在的淀粉酶产生菌，并对其16S rDNA进行序列分析得出菌的种属。
2 材料和方法2.1 仪器与材料2.1.1 材料淀粉厂周围土壤2.1.2 培养基实验过程中所采用的培养基，自行配置。
配置过程如下：1）产淀粉酶菌分离培养基——可溶性淀粉2%；蛋白胨1%；酵母膏0.5%；碳酸氢二钠0.5%；氯化钠0.01%；MgSO4·7H2O 0.01%；琼脂粉2%。
配置好后维持PH 为7.0-7.4,121℃高压灭菌20min。
2）菌体培养培养基——可溶性淀粉2%；蛋白胨2%；酵母膏0.5%；氯化钠0.01%；MgSO4·7H2O 0.01%。
配置好后维持PH为7.0-7.4,121℃高压灭菌20min。
产淀粉酶菌种的分离
产淀粉酶菌种的分离产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化一．设计背景淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。
是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂品种。
所以开始产淀粉酶菌种的分离、筛选、鉴定和产酶条件优化。
二．目的要求分离筛选出产淀粉酶菌种，并进行鉴定和产酶条件的优化三．实验技术步骤及详细流程采集含菌样品设计配制选择性培养基分装灭菌平板涂布分离纯化菌种（透明圈法）划线分离进一步纯化产酶菌种（透明圈法）液体培养法复筛产酶菌种，检测产酶性能目的菌种斜面和甘油保藏目的菌种的染色法显微观察目的菌种的常规生理生化鉴定考察紫外线对产酶菌种生长及产酶性能的诱变效应考察碳源或氮源种类及浓度对产酶菌种生长及产酶性能的影响考察PH对产酶菌种生长及产酶性能的影响1.采集含菌样品根据所选产酶菌种的要求，我们宜在淀粉制品霉变的样品中分离。
故在新校区的花坛中提前一周埋入淀粉制品（距离地表5cm左右），一周后用小铁勺在新校区的花坛中挖出泥土，放入提前准备好的塑料袋中。
2.培养基的配制2.1平板筛选培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%,可溶性淀粉2．0％，琼脂1．5～2．0％，pH自然。
121℃灭菌20min。
2.2摇瓶复筛培养基：玉米粉3％，玉米浆3％，CaCl20．13％，Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。
121℃灭菌20min。
2.3斜面保存培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。
pH7.0～7.2。
2.4种子培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0～20.0g，加蒸馏水至1000ml。
pH7.0～7.2。
2.5产酶液体培养基：玉米粉3％，玉米浆3％，CaCl20．13％，Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。
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第四小组
淀粉酶：是指一类能催化分解淀粉分子中糖
苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀 粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉 的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖 单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘 度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇 碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有 较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着 酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小 分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失， 因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为 指标来测定α-淀粉酶的活力。
酶活力测定： （1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养， 将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加 入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。 （2）酶液稀释： 取发酵液进行4000r/min离心 5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。 （3）标准曲线制作： 准备七支试管，按照下表 配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液在 660nm下的OD值。然后以淀粉浓度为横坐标， 吸光度为纵坐标，做标准曲线。
管号
淀粉稀释液/ml 缓冲液/ml
1
2(0%)
2
2(0.2%)
3
1
4
1
5
2(1.5%)
6
2(2.0%)
7
2(2.0%)
2(0.5%) 2(1.0%)
1
1
1
1
1
40摄氏度水浴保温5min 蒸馏水/ml 1 1 1 1 1 1 0 粗酶液/ml 0 0 0 0 0 0 1 40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min
试剂：碘液、2%可溶性淀粉、 pH6.0磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙 酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形 瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分 光光度计。 器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工 作台、恒温水浴锅、分光光度计。
实验步骤： 淀粉产生菌的筛选： （1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液； （2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养 基，倒平板备用； （3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉 膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一 天； （4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中， 继续放在37摄氏度培养箱中培养两天； （5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。
实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤
稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境 中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平 板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微 生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生 淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来 完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培 养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴 碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透 明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌 种产淀粉的能力。
实验器材料及试剂： 材料：河南科技学院花园土壤。 培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基 （牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于 1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至 7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时， 于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀 粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化 钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼 脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～ 7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。
稀碘液/m
1
1
（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照 下表中七号管的要求配置混合液，测得吸 光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓 度，求出被酶消耗的淀粉量。 （5）酶活力测定： 酶活力以每毫升粗酶 液在40摄氏度，pH6.0的条件下每小时所 分解的淀粉毫克数来衡量。
淀粉产生菌的筛选：