高效液相色谱分析

（三）分离度R
分离度的表达式：
R
2(t R (2) t R (1) ) Wb (2) Wb (1) 2(t R (2) t R (1) ) 1.699(Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) )
tR(2), tR(1): 组分2和组分1的保留时间 Wb(2), Wb(1): 组分2和组分1的峰底宽度
恒压泵特点 能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差。
9
柱 球 形 单 向 阀 电动机 偏心轮 柱塞 溶 剂
图10-7 柱塞往复泵示意图
10
（三）色谱柱
色谱柱是高效液相色谱分离过程的核心。一支稳定、高效的 色谱柱对建立适用性强、重现性好的分析方法是必不可少的。 1.担体 高效液相色谱的柱填料有离子交换树脂、凝胶，较多的使用 硅胶微粒作为担体。以下为几种常用的微粒类型： (1) 全多孔型担体：属于颗粒均匀的多孔球体，很好的兼顾 了效能、样品荷载量、耐久性等理想的性质，所以最为常用。 (2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，优点 是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易 于填充均匀，柱效高。这种担体目前应用较为普遍。
4
（二）柱效能
色谱柱在色谱分离中由动力学因素所决定的柱效能，通常 用塔板高度或塔板数表示。
塔板数：
2 t tR R n 5.54 16 Y1 W 2 2
涡流扩散相
塔板高度：
分子扩散相
B H A Cu u
流动相线速度 传质阻力相
5
符合郎伯-比耳定律。
优点：
灵敏度高，线形范围宽； 缺点： 死体积小； 无紫外-可见吸收组分不响应； 波长可选； 流动相选择受一定限制。 对流速和温度变化不 敏感； 可用于梯度洗脱。
18
(a) 可变波长紫外检测器
(b) 二极管阵列检测器
19
（二）、示差折光检测器—通用型检测器
每种物质具有不同的折光指数。
2
液相色谱流程与原理
◆ 基本原理：混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流 动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力 的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复 多次分配过程，使得原来分配系数具有微小区别的各组分 ，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在柱中的 移动速度不同，经过一定长度的色谱柱，彼此分离开来， 最后按一定顺序流出。
11
2.色谱柱
柱体为直型不锈钢管，标准内经为4.6或3.9 mm，柱长15～30 cm，填料 颗粒粒度5－10μm。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱经以提高 柱效。
为保护色谱柱，
通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。
12
3.固定相
选择固定相的一般标准还是以“相似相容”原理为基础。 如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低极性化合物，这样就 可以选择非极性或亚极性固定相。 若样品溶于极性温和溶剂中，如醇类，则可选择极性固 定相，也可以选择非极性固定相。
LOGO
高效液相色谱分析
基本概念与特点
◆ 概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经 典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采 用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器， 从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术 的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分 离分析手段. ◆ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
3
色谱图及相关名词
（一）色谱流出曲线—色谱图
色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间 或液体流出体积的曲线 。 色谱流出曲线是色谱基本参数的源流，而色谱基本参数又是 用来观察色谱行为和研究色谱理论的重要指标。另外，还可 以直接利用色谱图峰位置点（特征保留值）进行定性，根据 曲线上测得的峰高或峰面积进行定量。
基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间
的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓
度成正比。 生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，
一般要用示差折光检测器。
20
缺点：
灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。
21
（三）、荧光检测器—专用型检测器
基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中 的组分的浓度成之比。
6
R=1.5
完全分离
7
高效液相色谱系统
（一） 高效液相色谱仪结构流程
进样器 高压泵 色谱柱 检测器 储液瓶 废液 高压输液泵、高效分离柱、高灵敏度检测器
8
（二） 高压输液系统（高压泵）
高压输液泵是核心部件，要求：密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。 高压泵主要有恒流泵（往复泵）和恒压泵（气动泵）两种。 恒流泵特点 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无 关。分为机械注射泵和机械往复泵(常用)两种。
高效液相色谱
1.几乎可以分析各种物质
2.用于热不稳定物质的分析 3.色谱柱较短，柱效较低
4.没有较高灵敏通用检测器
5.流动相有毒，费用较高 6.运行和操作比GC难一些
7.仪器制造难度大
25
作者：应姗姗
谢谢
氧化铝固定相等。
Fra Baidu bibliotek
16
3 、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止 产生沉淀并在柱中沉积。
4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
17
（四）检测器
（一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器
基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择
性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系

13
4.流动相
液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。 流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况， 改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离
度的有效手段。
常用溶剂： 环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸 乙酯、甲醇 、乙腈、水等。
14
固定相极性>流动相极性 正相液相色谱 （正相柱） 组分极性越大，保留 时间越长；使用极性 化合物的分离。
凝胶过滤色谱
（二）定性与定量 参阅气相色谱的定性与定量方法。
24
气相色谱与高效液相色谱的比较
气相色谱
1.只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物 2.不能用于热不稳定物质的分析 3.用毛细管色谱可得到很高的柱效 4.有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器（FID和TCD） 5.流动相为气体，无毒，易于处理 6.运行和操作容易 7.仪器制造难度较小
固定相极性<流动相极性
反相液相色谱 （反相柱）
组分极性越小，保留 时间越长；适用非极 性化合物的分离。
15
选择流动相时应注意的问题
1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质
长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或
损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
22
特点：
高灵敏度； 高选择性；
可用于梯度洗脱。
23
定性与定量
（一）样品预处理 1.固体样品 固体样品首先要进行均质化，然后再采用如蒸馏、超临 界萃取或超声波萃取等技术进行样品制备。 2.液体样品
液-液萃取 固相萃取