支原体脂质相关膜蛋白在MAPK 信号通路中的相关作用

支原体脂质相关膜蛋白在MAPK 信号通路中的相关作用摘要：支原体膜表面存在着大量的脂质相关膜蛋白（lipid －associated mem －brane proteins ，LAMPs ）其结构与细菌的脂蛋白结构相似，在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理及病理过程。

在哺乳动物细胞中MAPK 亚族主要包括ERK1/2，JNK，p38 和 ERK5，其中 ERK5 近年来被发现对细胞的生存、增殖、调节血管生成有重要作用，这几条通路之间存在相互“对话”。

在传统的信号通路研究方法基础上，蛋白质组学的发展给信号通路研究开辟了一条新的道路。

关键词：支原体膜；丝裂原活化蛋白激酶；信号通路支原体是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核微生物，它在液体培养基的生长曲线与细菌相同，可分为迟缓期、对数生长期、稳定期、衰老期[1]。

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）可归属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属中的一员，是一种最小的原核微生物[2]。

目前，该病原在世界范围内广泛流行，由该病原引起的各类疫病给世界养牛业带来的损失也是不可估量的[3]，M.bovis已成为影响养牛业不可忽视的因素，因此，研究M.bovis对畜牧业发展意义重大。

MAPK,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

研究证实，MAPKs 信号转导通路存在于大多数细胞内,在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。

研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。

[4]为研究牛支原体脂质相关膜蛋白（ LAMPs ）激活 MAPK 信号通路诱导 EBL 细胞释放 IL-1β的分子机制，用牛支原体脂质相关膜蛋白刺激 EBL 细胞，发现牛支原体 LAMPs 能够诱导 IL-1β的表达。

进一步研究表明，p38 MAPK，ERK MAPK 和 JNK MAPK 信号通路在牛支原体 LAMPs 刺激 EBL 细胞诱导 IL-1β表达中起重要作用。

过表达 TLR1、TLR2，LAMPs 刺激 EBL 细胞，IL-1β的表达量增加。

进一步研究表明， TLR 接合体髓样化初级反应因子 88（MyD88）和 IRAK4 在 LAMPs 刺激 IL-1β诱导中起重要作用。

结果表明，牛支原体 LAMPs 刺激 EBL 由 TLR2 、TLR1 、MyD88 和 IRAK4 MAPK 信号通路细胞诱导 IL-1β的表达。

[5]1 在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路［6］。

1.1 ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号通路在哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，目前对其激活过程及生物学意义已有了较深入的认识。

研究证实，受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联的受体和部分细胞因子受体均可激活ERK信号转导途径。

如：生长因子与细胞膜上的特异受体结合，可使受体形成二聚体，二聚化的受体使其自身酪氨酸激酶被激活；受体上磷酸化的酪氨酸又与位于胞膜上的生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的SH2结构域相结合，而Grb2的SH3结构域则同时与鸟苷酸交换因子SOS（Son of Sevenless）结合，后者使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的GDP解离而结合GTP，从而激活Ras；激活的Ras进一步与丝／苏氨酸蛋白激酶Raf-1的氨基端结合，通过未知机制激活Raf-1；Raf-1可磷酸化MEK1／MEK2（MAP kinase／ERK kinase）上的二个调节性丝氨酸，从而激活MEKs；MEKs为双特异性激酶，可以使丝／苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，最终高度选择性地激活ERK1和ERK2（即p44MAPK和p42MAPK）。

ERKs 为脯氨酸导向的丝／苏氨酸激酶，可以磷酸化与脯氨酸相邻的丝／苏氨酸。

在丝裂原刺激后，ERKs接受上游的级联反应信号，可以转位进入细胞核。

因此，ERKs不仅可以磷酸化胞浆蛋白，而且可以磷酸化一些核内的转录因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc和ATF2等，从而参与细胞增殖与分化的调控。

另外，ERK还可以磷酸化ERKs通路的上游蛋白如NGF受体、SOS、Raf-1、MEK等，进而对该通路进行自身的负反馈调节。

还有研究发现，ERKs可磷酸化胞浆内的细胞骨架成份，如微管相关蛋白MAP-1、MAP-2和MAP-4，参与细胞形态的调节及细胞骨架的重分布。

最近，国外学者又新克隆出ERK5及其上游激酶MEK5，这条MAPKs信号通路可被H2O2及高渗刺激活［7］，其底物为c-Myc。

通过分子生物学技术发现还有ERK3 Kinase／ERK3及ERK4两条通路存在，但目前对其激活信号、底物及生物学意义还不清楚。

1.2 JNK／SAPK通路c-Jun氨基末端激酶（JNK）又被称为应激活化蛋白激酶（SAPK），是哺乳类细胞中MAPK的另一亚类。

目前，从成熟人脑细胞中已克隆了10个JNK异构体，它们分别由JNK1、JNK2和JNK3基因编码［8］，分子量46000的JNK1和分子量55000的JNK2在各种组织细胞中广泛表达，而JNK3选择性在脑细胞中表达。

JNK／SAPK信号通路可被应激刺激（如紫外线、热休克、高渗刺激及蛋白合成抑制剂等）、细胞因子（TNFα，IL-1）、生长因子（EGF）及某些G蛋白偶联的受体激活。

外界刺激可通过Ras依赖或非Ras依赖的两条途径激活JNK，小分子G蛋白Ras超家族的成员之一Rho可能也是JNK激活的上游信号［9］，Rho蛋白Rac及cdc42的作用可能是与p21激活的丝／苏氨酸激酶PAK结合，使其自身磷酸化而被激活，而活化的PAK进一步使JNK激活。

已有研究证实，双特异性激酶JNK Kinase（JNKK）是JNK／SAPK的上游激活物，包括MKK4（JNKK1）、MKK7（JNKK2），其中MKK7／JNKK2可特异性地激活JNK［10］，而MKK4则可同时激活JNK1和p38。

JNKK的上游激活物为MEKK，MEKK1在体外过表达时可激活MEK，但MEKK1在体内高度选择性地磷酸化MKK4，从而激活JNK［11］。

MEKK2也可通过MKK4激活JNK和p38。

JNK／SAPK接受上游信号被激活后，可以进一步使核内的转录因子c-Jun氨基末端63及73位的丝氨酸残基磷酸化，进而激活c-Jun而增强其转录活性［12］。

c-Jun 氨基末端的磷酸化还可以促进c-Jun／c-Fos异二聚体及c-Jun同二聚体的形成，这些转录因子可以结合到许多基因启动子区AP-1位点，增加特定基因的转录活性。

此外，JNK／SAPK激活后还可以使转录因子Elk-1和ATF2发生磷酸化，并使其转录活性增强。

1.3 p38MAPK通路p38MAPK是1993年由Brewster等人在研究高渗环境对真菌的影响时发现的［13］。

以后又发现它也存在于哺乳动物的细胞内，也是MAPKs的亚类之一，其性质与JNK相似，同属应激激活的蛋白激酶。

目前已发现p38MAPK有5个异构体，分别为p38α（p38）、p38β1、p38β2、p38γ、p38δ。

其分布具有组织特异性：p38α、p38β1、p38β2在各种组织细胞中广泛存在，p38γ仅在骨骼肌细胞中存在，而p38δ主要存在于腺体组织。

研究证实，p38MAPK通路的激活剂与JNK通路相似。

一些能够激活JNK 的促炎因子（TNFα、IL-1）、应激刺激（UV、H2O2、热休克、高渗与蛋白合成抑制剂）也可激活p38，此外，p38还可被脂多糖及G＋细菌细胞壁成分所激活。

p38信号通路也由三级激酶链组成，其上游激活物为MKK3、MKK4及MKK6，与MKK4不同，MKK3、MKK6仅特异性激活p38［14］。

体外细胞转染实验表明，MEKK2。

MEKK3可通过激活MKK4同时激活JNK和p38，而MEKK3通过激活MKK3特异性激活p38。

不同的p38异构体对同一刺激可有不同的反应，IL-1对p38的激活明显强于p38β，TNF1-α使p38活性达到高峰的时间明显短于使p38β达到高峰的时间［15］。

不同的异构体对底物的作用也具有选择性，p38 β2对ATF2的磷酸化作用明显强于p38，p38γ可以磷酸化ATF2，但却不能激活MAPKAP-K2和MAPKAP-K3［16］；不同的异构体与不同的上游激酶偶联，MKK6可以激活p38α、p38β2、p38γ，而MKK3仅能激活p38α、p38γ。

2支原体膜表面相关膜蛋白在信号通路上的作用支原体膜表面存在着大量的脂质相关膜蛋白（lipid －associated mem －brane proteins ，LAMPs ）其结构与细菌的脂蛋白结构相似，在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用，并且能够与细胞膜表面受体结合，激发宿主的免疫应答［17］。

LAMPs 可诱导宿主非特异性和特异性免疫损伤，或者直接被宿主细胞膜上的 Toll 样受体（ TLR ）识别而启动相应的凋亡信号，从而直接诱导细胞凋亡［ 18-19 ］。

IL-1β 是一个重要的细胞因子，在机体的免疫应答和炎性反应等生物进程中发挥着重要的作用。

同时，IL-1β 已经被证实主要受NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK ）信号通路所调控［20 ］。

MAPK 信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理及病理过程［ 21 ］。

应用 MAPK 三条支路 P38 、 JNK 、 ERK 特异性抑制剂分别处理细胞，过表达 MAPK 信号通路上TLR1 、 TLR2 、 MyD88 、 IRAK4 分子，进行支原体LAMPs诱导 EBL 细胞 IL-1β 释放的分子机制研究。

三种抑制剂阻断 MAPK 信号通路的结果发现， LAMPs 刺激EBL 细胞可引起 ERK 、 JNK 和 p38 MAPK 途径的激活，说明 ERK 、 JNK 和 p38 通路有可能共同参与IL-1β 的转录表达调控， ERK 通路、 JNK 通路和 p38通路单独激活都能在不同程度上诱导 IL-1β 的释放，而每条通路的抑制可降低IL-1β 的表达量。