新分子检测技术在肺癌精准治疗中的应用NGS-vs-ddPCR知识讲解
NGS基因组测序技术在个性化医学中的应用前景
NGS基因组测序技术在个性化医学中的应用前景随着科技的不断进步和医学的发展，个性化医学成为医疗领域的一个重要发展方向。
个性化医学旨在根据个体的基因组信息，提供针对性的诊断和治疗方案，以改善患者的预后和生活质量。
NGS基因组测序技术（Next-generation sequencing）作为一种高通量测序方法，正在个性化医学领域引起广泛关注，并有望成为未来个性化医学的重要工具。
本文将探讨NGS基因组测序技术在个性化医学中的应用前景。
首先，NGS技术在癌症领域中的应用具有巨大潜力。
癌症是一类复杂的疾病，不同患者的癌症基因组有所不同，基因驱动突变是癌症发生和发展的重要原因。
NGS技术可以高通量、快速且准确地测序患者癌症相关基因或突变位点，帮助医生了解患者的个体差异，从而实现个性化的癌症治疗。
通过对癌症基因组的深入研究，可以发现与疾病相关的新的靶向治疗方法，并为研发新药提供依据。
此外，NGS技术可以辅助医生进行肿瘤早期筛查和监测，提高癌症的早期诊断率和治疗效果，极大地改善患者的生活质量。
其次，NGS技术在遗传病领域中的应用也具有广阔的前景。
遗传病是由基因突变或遗传变异引起的疾病，对遗传病进行准确的诊断和筛查对患者的治疗和管理至关重要。
传统的遗传病诊断方法往往仅能检测部分常见的基因突变，且费时费力。
而NGS技术可以同时测序多个基因，包括罕见突变，快速且准确地确定遗传病的病因，为患者提供精准的诊断和治疗方案。
此外，NGS技术还可以帮助家族成员进行遗传风险评估，提前采取相应的预防和干预措施。
此外，NGS技术在个体化用药和药物开发领域也有着巨大的潜力。
药物反应的个体差异常常根源于基因型的不同。
NGS技术可以快速测序个体的基因组，并根据个体基因组的特征，为患者提供个体化治疗方案，包括药物剂量和类型的选择。
个体化用药可以提高治疗的效果，减少药物副作用，提高患者的治疗依从性。
此外，NGS技术还可以帮助药物研发领域的科学家加速新药开发和临床试验的进程，为研究和开发更安全、有效的药物提供支持。
分子诊断技术的最新进展
分子诊断技术的最新进展分子诊断技术是当今医学领域中最为热门的研究方向，也是未来医疗发展的一个重要方向。
该技术可以通过检测和分析体内的分子物质，为疾病的早期诊断和治疗提供了可能。
在最近的几年里，分子诊断技术得到了快速发展，不断涌现出新的技术和方法，为我们开启了新的窗口。
本文将以该领域的最新进展为主题，并从多个角度介绍它的研究方向及未来趋势。
一、NGS技术+全基因组测序随着NGS技术的不断成熟，全基因组测序在分子诊断领域得到了广泛的应用。
在疾病的诊断和治疗中，全基因组测序可以快速而准确地确定患者的基因组序列，为分子诊断提供了更为精确的参考。
当前，在全基因组测序领域最为注目的是单细胞测序技术，它可以实现对单个细胞的基因组测序。
可用于检测早期肿瘤的突变，还可用于个体化医学，为不同患者提供不同的治疗方案。
二、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技术是当前最具热门的基因编辑技术之一，是一种基于RNA的程序化核酸切割工具。
该技术可以快速而准确地定位并切割DNA序列，从而在基因水平上实现对疾病的治疗。
该技术可以用于修复有缺陷的基因，防止遗传疾病的传播，甚至在对抗癌症等方面具有潜力。
目前，CRISPR-Cas9技术正在经历着从实验室研究到临床试验的转变。
值得一提的是，文献报道了利用该技术可以将异常细胞的基因修正为正常细胞，从而制造一种自我改善的生物体。
三、芯片技术芯片技术是一种将分子生物学、电子技术和计算机技术相结合的技术，其主要功能是将分子物质固定在特制的微型管壁上，以实现分子的快速检测和分析。
芯片技术可以通过微型反应腔的灵活设计，将多个生物分子相互干扰的反应隔离开，以更加精确地检测和分析生物分子的性质。
四、蛋白质组学技术除了基因组学技术外，蛋白质组学技术也是目前研究最为活跃的分子诊断技术之一。
该技术以质谱为核心，通过检测和分析蛋白质的性质，从而探索其在疾病诊断和治疗中的应用。
可用于分离蛋白质，鉴定其分子量和特定的质量分子以获得蛋白质的序列信息，从而获得更多关于蛋白质功能和性质的研究。
分子诊断的未来基因检测VS液体活检
分子诊断的未来基因检测VS液体活检未来基因检测与液体活检是两种新兴的分子诊断技术，它们在癌症诊断和治疗中扮演着重要的角色。
本文将就未来基因检测和液体活检的原理、应用以及各自的优缺点进行比较和探讨。
一、未来基因检测未来基因检测（Next Generation Sequencing，简称NGS）是一种基于高通量测序技术的分子诊断方法。
与传统的Sanger测序相比，NGS能够同时对多个基因进行测序，大大提高了测序效率和准确性。
未来基因检测的原理是将被检测样本中的DNA经过文库构建、片段扩增、高通量测序等步骤，生成大量的测序数据。
通过对这些数据进行比对和分析，可以获取样本中的基因序列信息，并进一步研究基因突变、拷贝数变异、染色体结构变异等。
未来基因检测在癌症诊断中有着广泛的应用。
通过检测癌症相关基因的突变情况，可以为临床提供更加准确的诊断结果。
此外，未来基因检测还可用于预测患者对某些治疗方案的响应程度，为临床治疗提供个体化的指导，提高治疗效果。
然而，未来基因检测也存在一些限制。
首先，高通量测序在产生大量测序数据的同时，也带来了数据处理和分析的难题，需要复杂的生物信息学技术支持。
其次，未来基因检测的费用较高，限制了其在临床中的普及应用。
此外，未来基因检测对样本的纯度和质量要求较高，样本处理的环节可能会对检测结果产生影响。
二、液体活检液体活检（Liquid Biopsy）是一种通过检测体液中的肿瘤相关标志物来进行癌症筛查、监测和评估的非侵入性诊断技术。
常见的液体活检样本包括血液、尿液和唾液等。
液体活检的原理是通过检测体液中游离核酸（circulating free DNA，简称cfDNA）和肿瘤细胞释放的细胞外囊泡中的特定标志物，如突变基因、DNA甲基化等，来判断肿瘤的发生、进展和治疗效果。
液体活检具有许多优势。
首先，它是一种非侵入性的检测方法，无需对肿瘤进行穿刺或切除，避免了手术风险和痛苦。
其次，液体活检可以实时监测肿瘤的动态变化，为治疗的调整和评估提供了有效的手段。
肺癌的诊断和治疗新进展
肺癌的诊断和治疗新进展肺癌是一种非常常见的癌症类型，它的发病率和致死率都在不断的增加。
目前，肺癌依旧是全球范围内癌症死亡的最主要原因之一。
尽管肺癌发生的原因十分复杂，但随着生物技术、分子利用以及疾病管理的不断进步，肺癌的诊断和治疗也出现了很多新的进展和方法。
在本文中，我们将探讨一些最新的技术和治疗方法，为肺癌患者提供参考。
肺癌的新型诊断方法实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是目前肺癌的主流检测方法之一。
患者的肺组织和肺部血液样本可以用来检测肿瘤基因的表达，其特异性和灵敏度都非常高。
这个方法还可以对肺癌的基因表达谱进行分析，以确定每个患者的独特的肿瘤类型。
这使得患者可以得到个性化的治疗方案，并且可以有效地避免药物治疗的不良反应，提高治疗效果。
此外，还有像血浆肿瘤DNA检测和呼吸道微生物学检测等测试，也可以用于肺癌的诊断与筛查。
血浆肿瘤DNA检测是利用肿瘤细胞在分裂时释放的DNA作为检测物，通过PCR扩增和测序技术来检测极微量的癌细胞DNA。
这个方法减少了肺癌测试的侵入性，提供了一种无创的检测技术，但还需要大规模的临床试验来验证其安全性。
呼吸道微生物学检测可以帮助防止肺癌的误诊，因为在许多情况下一些肺癌患者在中低期时可能被误诊为结核病或肺炎。
肺癌的新型治疗方法靶向治疗是一种选择性地杀死癌细胞，不伤害正常细胞的治疗方法。
以 EGFR 靶向治疗为例，它是一种专门针对表皮生长因子受体，即 EGFR 激酶刺激增殖的治疗。
这个治疗方法是因为在很多肺癌患者的细胞表面富含 EGFR，所以可以直接靶向这个受体来杀死癌细胞。
近年来，许多新型 EGFR 抑制剂(Dacomitinib、Gefitinib等)也正在研制并已获得临床试验认证。
免疫疗法是另一种新型的治疗方法，它与靶向治疗不同，这种方法并不直接针对肺癌细胞，而是增强人体免疫机制，让人体自身的免疫细胞能够发现和杀死肺癌细胞。
免疫疗法主要可以分为癌症疫苗和抗 PD-1/L1 抗体疗法两种。
NGS技术在肿瘤发展和转移机制解析上的最新进展h
NGS技术在肿瘤发展和转移机制解析上的最新进展h近年来，肿瘤发展和转移机制的研究一直是生物医学领域的热点之一。
随着高通量测序（Next-Generation Sequencing，NGS）技术的迅猛发展，科研人员能够更全面、更快速地解析肿瘤细胞的遗传变异、基因表达和表观遗传修饰等信息，为肿瘤发展和转移机制的解析提供了强有力的手段。
NGS技术的出现改变了肿瘤研究的方式。
相比传统的测序方法，NGS技术具有高通量、高灵敏度、高准确性和较低成本的特点，可同时测定多个样品的DNA或RNA序列信息，为肿瘤研究提供了更多的可能性。
以下将探讨NGS技术在肿瘤发展和转移机制解析上的最新进展。
首先，NGS技术可用于揭示肿瘤细胞的遗传变异。
肿瘤发展和转移过程中存在大量的基因突变、染色体缺失、拷贝数变异和重排等遗传变异。
通过NGS技术，可以全面而快速地检测出肿瘤细胞中的DNA序列变化，包括点突变、非同义突变、插入缺失和基因融合等多种类型的变异。
此外，NGS技术还可用于检测肿瘤细胞中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）和结构性变异，进一步深入理解肿瘤的个体差异性和遗传背景对肿瘤发展的影响。
其次，NGS技术在肿瘤中基因表达的研究具有广泛应用前景。
肿瘤细胞的转录组是其基因表达的整体反映，可以揭示细胞各种功能和代谢状态的变化。
NGS技术可以通过测量RNA序列的相对丰度和外显子的可变剪接，高通量测定肿瘤细胞中不同基因的表达水平和变化情况，从而帮助研究人员揭示肿瘤细胞中关键基因的异常表达，并进一步探究其与肿瘤发展和转移的关联。
此外，基于NGS技术的RNA测序还可用于全转录组重测序（TotalRNA Sequencing，RNA-Seq）、蛋白编码序列（Coding DNA Sequencing，CDS）、差异表达基因分析（Differential Expression Analysis，DE）和共表达基因网络分析等，为深入了解肿瘤的转录组特征提供了全方位的研究手段。
NGS技术在新药研发中的应用前景
NGS技术在新药研发中的应用前景随着科学技术的不断发展和进步，新一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术的出现为医药领域带来了巨大的改变。
NGS技术不仅在基础研究中广泛应用，也在新药研发中发挥着重要的作用。
本文将重点探讨NGS技术在新药研发中的应用前景。
首先，NGS技术在寻找药物靶点方面具有巨大潜力。
传统的药物开发过程需要通过大量的实验来筛选潜在的药物靶点，耗时且成本高昂。
而NGS技术可以对基因组进行高通量测序，快速获得大量的基因和非编码RNA信息。
通过分析这些数据，科研人员能够识别出与疾病相关的潜在药物靶点，并加快开发新药的速度。
其次，NGS技术在新药研发中有助于精准医学的发展。
精准医学的核心在于将个体的基因信息与疾病的预防、诊断和治疗相结合，以实现个性化医疗。
NGS技术的高通量测序能够迅速获得患者的基因组信息，并通过分析这些数据来精确预测疾病的风险、确定最佳的治疗方案以及预测药物疗效。
这使得医生能够根据个体的基因信息，为患者提供更准确、个性化的治疗策略，提高疗效和预防药物的不良反应。
此外，NGS技术还能够在药物安全性评估方面发挥重要作用。
传统的药物安全性评估主要基于动物试验，然而动物模型无法完全代表人类体内的生理和代谢过程，因此很难预测药物的毒副作用。
NGS技术的高通量测序对于研究毒副作用基因的不同表达具有很高的敏感性，可以帮助科研人员找到与药物反应有关的基因标记，从而提前预测潜在的毒副作用，并加以避免。
这不仅可以提高药物的安全性，还可以减少动物试验的使用，降低新药研发的成本。
另外，NGS技术的应用还可以加快对药物作用机制的理解。
药物的治疗效果与药物与人体基因组的相互作用密切相关。
NGS技术可以通过测序药物靶点的基因组，揭示药物与基因之间的相互作用关系，从而帮助科研人员深入了解药物的作用机制。
这对于设计更高效、更具针对性的药物治疗方案非常重要，并且有助于研发新型的治疗手段。
NGS在肺癌中的应用与报告解读
NGS
一代测序 FISH ARMS
RTPCR
IHC
代谢产物
肺癌中越来越多的变异被定义为actionable靶点
应用一：多基因平行检测能够增加患者接受靶向治疗的机会
平行检测NCCN指南推荐8基因
检测基因型
EGFR突变 ALK重排/融合
HER2突变 BRAF V600E突变 MET扩增/14外显子跳读
E6:A20
E20:A20
Differential Crizotinib Response Duration Among ALK Fusion Variants in ALKPositive Non–Small-Cell Lung Cancer
Yoshida T, et al. Journal of Clinical Oncology. 2016. June 27 on line
病例三：EGFR TKI治疗后继发多重耐药机制
突变的临床解读
✓ 临床意义
✓ 对应靶向药物
✓ 敏感性、耐药性？
Relationship level
Implication1
Implication2
Implication3 Implication4 Implication5
敏感
可能敏感
FDA/NCCN 1A FDA/NCCN 1B
EGFR突变 ALK重排/融合
HER2突变 BRAF V600E突变 MET扩增/14外显子跳读 ROS1重排/融合
RET重排/融合 KRAS突变 TOTAL
可根据临床需求和患者经济承受能力选择不同大小的panel
问题2：应该检测多少位点？全外显子？
基因！=位点 基因包含成千上万个位点
点突变&插入缺失
ddpcr的原理和医学应用
ddpcr的原理和医学应用简介数字PCR（digital PCR, ddPCR）是一种高灵敏度的PCR技术，通过将DNA模板分成微小的反应区域来进行扩增和检测，从而能够实现对少量DNA的高精度定量和突变检测。
本文将介绍ddPCR的原理和医学应用。
ddPCR的原理ddPCR基于传统PCR技术，但是引入了分离扩增产物的步骤，可以准确计数PCR反应中的DNA分子。
其主要原理包括以下几个步骤：1.样品的分割：采用微型芯片或微滴技术，将PCR反应混合物分割成许多微小的反应区域。
2.DNA的扩增：在每个微小反应区域中进行PCR扩增反应，使得模板DNA被扩增。
3.检测：通过荧光或荧光探针的方式对每个微小反应区域进行检测，判断是否有目标序列的扩增产物。
ddPCR相比传统PCR的优势在于它能够将PCR反应区域限制在正常范围内，从而有效降低PCR扩增的偏差和噪声，提高扩增产物的准确性和可靠性。
ddPCR的医学应用ddPCR在医学领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1. 基因突变检测ddPCR可以实现对基因突变的高灵敏度检测。
通过针对特定突变位点设计引物和探针，可以将突变位点与野生型位点区分开来，并定量计数突变位点的存在情况。
这对于肿瘤等疾病的诊断和预后有着重要意义。
2. 微生物检测ddPCR可以应用于微生物的定量和检测。
通过设计特异性引物和探针，可以准确计数微生物的存在量，判断感染程度和治疗效果。
在临床实验室和环境监测中，ddPCR已经被证实是一种可靠且有效的微生物检测方法。
3. 人体液体检测ddPCR可以在人体液体中寻找稀有的DNA分子，例如循环肿瘤细胞（CTCs）和胎儿DNA。
通过对这些稀有DNA分子进行定量和分析，可以实现早期肿瘤的筛查和诊断，以及无创产前诊断。
4. 基因表达分析ddPCR可以用于基因的定量和表达分析。
通过测量DNA模板的扩增产物，可以精确计算基因的拷贝数，并分析基因的表达水平。
这对于研究基因调控和疾病发生机制有着重要的意义。
NGS在肺癌中的应用与报告解读
C
肿瘤细胞占比66%，突变丰度33%
肿瘤组织中的突变丰度与肿瘤细胞占比 密切相关
*在发生拷贝数变异的情况下，突变丰度可能会超过50%
问题6 组织中的低丰度突变是否意义不大？
组织病理评估可以帮助解读肿瘤组织的检测结果，突变的丰度与肿瘤细胞占比密切相关。 未有研究表明，低丰度突变不能指导用药。传统ARMS检测不区分丰度
肿瘤负荷大的晚期病人ctDNA丰度高 肿瘤负荷小的早期病人ctDNA丰度低
组织突变丰度 vs 血液突变丰度
突变丰度范围 关键因素
因素如何评估
影响因素
肿瘤组织
血检cfDNA
1% ~ 99%
0.01% ~ 99%
肿瘤细胞占比
ctDNA / cfDNA
可病理评估（粗略估计）
无法直接评估。利用突变 丰度来倒推ctDNA丰度
NGS在肺癌中的应用与报告解读
张周 燃石医学生物信息总监
2017.09
提纲 /CONTENTS
NGS检测在肺癌中的应用
多基因平行检测---预期检出多少突变？ 组织+液体活检---有什么临床价值？ 突变丰度---临床意义？
NGS检测报告解读案例
肿瘤是因为基因变异导致的疾病
分子病理检测
DNA
RNA 蛋白
丰度反映不同亚克隆的比例关系，可动态监控肿瘤的时空演化
EGFR L858
EGFR L858
• Allele Fraction(AF) = “A” / total depth=4/14=28.5%
• 突变丰度体现突变的DNA占所有DNA 的比例（肿瘤细胞占比）
Wild type 野生型 == “G” Mutation 突变型 == “A”
二代测序(NGS)在肿瘤检测中的应用
二代测序（NGS）在肿瘤检测中的应用什么是二代测序？二代测序是一种高通量测序技术，又称为下一代测序，指的是与Sanger测序技术相比，能同时进行大量DNA或RNA序列测序的新一代测序技术。
二代测序主要包括Illumina、Ion Torrent、BGI等不同平台，都具有高通量、高灵敏度、高精度、低成本等优势。
它已经广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学以及其他生命科学领域的研究和应用中。
二代测序的优缺点相较于传统的sanger测序、PCR技术、FISH等，二代测序优点有哪些？01产量高：能够一次性测序数百万到数千万条读段，比传统高出好几个数量级，大大提高了测序数据的覆盖率和可靠性。
02准确性高：高质量的测序和分析能够避免Sanger测序中的一些错误，如Sanger测序就很难以高的可信度将7个A和8个A区分开来。
03灵敏度高：能够检测到低浓度样本中的DNA或RNA。
04检测范围广：能够同时进行多种基因检测。
对于只能切一次的小样本，又同时需要多种基因检测，二代测序是最好的选择，这对患者意义重大。
二代测序也能够用于基因组学、转录组学、表观遗传学等多个领域的研究和应用。
05成本低：相比传统测序技术，二代测序每个基因的成本更低。
当然二代测序也有些短板：01对样本质量要求较高：如果样本有大量炎症、坏死、氧化等可能导致数据质量的下降。
02数据分析难度较大：由于数据量大、质量不一和分析方法复杂等问题，对数据分析和解读的要求较高。
03报告周期长：相对于传统检测，二代测序复杂的实验流程和分析需要耗费时长更长。
二代测序对肿瘤患者有什么意义呢？二代测序在肿瘤领域中，可以帮助医生更好地了解肿瘤的性质、演化过程和药物敏感性等，从而为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供更精准的指导。
具体包括以下几个方面：01帮助诊断二代测序技术可对患者的基因组进行全面测序，帮助医生判断某些疾病是否是遗传性的。
对于有明显家族肿瘤史者，有必要进行特定的遗传性肿瘤综合征基因检测。
肿瘤细胞基因突变的快速检测技术
肿瘤细胞基因突变的快速检测技术肿瘤是一种常见的疾病，它的形成涉及到基因突变，而快速准确地检测肿瘤细胞的基因突变对于肿瘤的治疗和预后具有重要意义。
在近些年，肿瘤细胞基因突变的快速检测技术不断发展，可以通过多种方法进行检测，如下文所述。
首先介绍的是PCR（聚合酶链反应）技术。
PCR技术是一种将DNA扩增的方法，它能对肿瘤细胞中的基因进行快速检测。
PCR 技术是通过特殊的酶，将DNA链的两端不断进一步复制，从而形成大量的DNA分子。
在PCR技术中，我们可以将特定的一段DNA序列扩增，从而检测基因突变。
这种方法可快速准确地检测出肿瘤细胞基因的突变情况。
其次是基于Nanopore技术的检测方法。
Nanopore技术是新兴出现的一种基于纳米孔的单分子检测技术。
Nanopore技术可以将试样分成很小的单元，然后通过纳米孔通道测量样品中不同的成分。
在肿瘤细胞的基因检测上，Nanopore技术可以实现对具有高度变异的基因区域进行快速检测，从而提高肿瘤检测的准确率。
另一种方法是利用NGS（下一代测序）技术。
NGS技术是一种高通量DNA测序方法，可以将该样品DNA中的所有序列片段同时测序并得到数据。
在肿瘤细胞检测中，该技术可将基因突变的信息与参考基因库进行比对，从而快速准确地发现肿瘤细胞中的基因突变。
通过NGS技术分析，医生可以精准地针对患者的病情，进行个性化的治疗方案设计。
最后，基于电泳的检测技术也是一种常见方法。
在肿瘤细胞基因突变的快速检测方面，电泳技术可以识别DNA序列中的单核苷酸变异（简称SNV）或结构变异（简称SV）。
电泳技术基于电极原理，可以将DNA序列按碱基组成的大小不同进行分离，从而实现来自临床样本和细胞系的SNV和SV基因检测。
总之，随着技术的不断进步和发展，对肿瘤细胞基因突变的快速检测成为了一种非常重要的手段。
无论是PCR技术，还是Nanopore技术、NGS技术或电泳技术，都提供了精准、灵敏、可靠的检测手段，在临床肿瘤治疗中起到了重要作用。
ddpcr原理
ddpcr原理ddPCR（Droplet Digital PCR）是一种高灵敏度、高精确度的分子生物学技术，可以用于定量分析DNA、RNA或蛋白质的数量。
它通过将DNA、RNA或蛋白质样本分成许多微小的液滴，并在每个液滴中进行PCR反应，从而实现对目标分子的准确计数。
ddPCR 在生物医学研究、临床诊断和基因组学等领域具有广泛应用前景。
ddPCR的原理是基于传统的PCR（聚合酶链式反应）技术，但有一些独特之处。
首先，ddPCR将样本分成大量微小的液滴，每个液滴中含有零个或一个目标分子。
通过稀释样本，可以确保每个液滴中只有很少的目标分子存在，从而使得每个液滴的PCR反应达到指数级扩增。
这种稀释的效果使得ddPCR能够准确计数目标分子的数量。
ddPCR利用荧光探针或引物来标记目标分子。
在PCR反应过程中，荧光标记的探针或引物会与目标分子结合，并在PCR扩增的过程中释放出荧光信号。
通过检测每个液滴中的荧光信号，可以确定每个液滴中是否存在目标分子。
利用这种方法，可以实现对目标分子的高灵敏度检测。
ddPCR还可以通过多个荧光探针或引物来检测多个目标分子。
每个目标分子都有一个特定的荧光标记，可以在同一个PCR反应中同时检测多个目标分子。
这种多重检测的能力使得ddPCR在研究多个基因的表达水平或检测多个病原体的存在时非常有用。
ddPCR还具有高精确度的特点。
传统的PCR技术在目标分子数量较低时，往往会出现测量误差。
而ddPCR可以通过计算每个液滴中目标分子的存在概率，从而准确地确定目标分子的数量。
这种精确度使得ddPCR在精确定量分析和疾病诊断中具有重要的应用价值。
在实际应用中，ddPCR可以用于检测基因突变、基因表达水平、病原体感染等。
例如，在肿瘤学研究中，ddPCR可以用来检测肿瘤相关基因的突变，并评估突变的频率。
在临床诊断中，ddPCR可以用来检测病原体的存在，并确定感染的程度。
此外，ddPCR还可以用于分析罕见基因突变或检测少量的循环肿瘤DNA，这在癌症早期诊断和治疗监测中具有重要意义。
NGS系列讲座——NGS基本原理
NGS系列讲座——NGS基本原理NGS（Next-Generation Sequencing）是一种高通量的DNA测序技术，也是现代生物学研究中重要的工具之一、NGS的出现极大地推动了基因组学、转录组学、蛋白质组学等领域的研究进展。
本文将重点介绍NGS的基本原理，并对相关技术进行简要的说明。
NGS技术的基本原理可以简单概括为将待测DNA大分子序列分割成小片段，然后通过并行进行大规模的测序，并最后将这些小片段的测序结果进行拼接，以获取原始DNA序列。
具体的步骤包括DNA样本的制备与库构建、DNA片段的文库构建、测序、数据处理与分析等。
首先，NGS技术需要将待测DNA样本进行处理和制备，一般包括DNA的提取、纯化和断裂。
断裂后的DNA片段可以通过两种不同的方式进行文库构建。
一种是通过PCR（聚合酶链式反应）扩增的方式构建文库，该方法适用于高测序深度的应用，例如全基因组测序。
另一种方式是利用适应性文库构建方法，如特定酶切、连接适配体、聚合酶链式反应等。
这种方法适用于低测序深度的应用，例如RNA-seq、甲基化测序等。
接下来，构建好的文库会经过芯片装片和测序前处理，测序前处理一般包括DNA片段的扩增、芯片上的密集排列和相应的预处理过程。
然后，测序过程会根据所使用的技术进行不同的处理。
目前常见的测序技术包括Illumina/Solexa、Roche/454和Ion Torrent等。
Illumina/Solexa技术是目前最主流的NGS测序技术之一，它基于测序-by-synthesis的原理，通过使用碱基特异性荧光标记的核苷酸来产生荧光信号，并将每个碱基对应的信号进行记录。
Roche/454技术则是通过测量平均每个附着到DNA链末端的分光光度单位的发光来实现测序。
Ion Torrent则是利用质子发生器件测量质子释放来实现测序。
最后，测序得到的数据会通过各种算法进行处理与分析。
一般包括数据质量控制、序列比对、变异检测等步骤。
NGS新一代测序技术在基因组研究上的应用与创新
NGS新一代测序技术在基因组研究上的应用与创新新一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是近年来基因组研究领域的重要工具，这种技术的应用与创新为基因组学领域带来了巨大的进展。
NGS技术以其高通量、高准确性和低成本等特点，使得基因组研究变得更加迅速和高效。
本文将介绍NGS在基因组研究中的应用，并探讨其在该领域的创新。
首先，NGS技术在基因组研究中的应用范围广泛。
通过对大量基因组DNA的快速测序，NGS技术可以揭示基因组的组成和结构，并帮助研究人员识别基因组中的变异。
这样的应用为寻找与人类疾病相关的基因提供了便利，进而有助于疾病的早期诊断和个性化治疗。
另外，NGS技术还能够用于检测和分析肿瘤样本中的突变，从而帮助研究人员深入了解肿瘤的致病机制以及设计更加准确的肿瘤治疗策略。
其次，NGS技术在基因组研究中的创新之处在于其能够进行整个基因组的测序。
与传统的Sanger测序方法相比，NGS技术能够同时测序大量的DNA分子，并以并行模式进行测序，大大加快了测序速度。
这使得研究人员可以更加全面地了解基因组的组成，揭示基因之间的相互作用及其功能。
此外，NGS技术的高通量测序使得研究人员可以在相对较短的时间内对大样本进行测序，从而提高了实验效率。
这种高通量测序的能力在种群遗传学研究中尤为重要，通过对大量个体的基因组测序，可以更好地理解基因之间的变异及其与个体特征之间的关系。
NGS技术的应用与创新不仅体现在基因组的测序，还体现在数据分析和生物信息学工具的发展上。
随着NGS技术的快速发展，测序数据的规模和复杂性不断增加。
为了应对这些挑战，研究人员开发了一系列有效的生物信息学工具和算法，以便快速处理和分析大规模的测序数据。
这些工具和算法的发展不仅提高了数据处理的效率和准确性，还为更深入的基因组研究提供了有力的支持。
例如，研究人员可以利用这些工具来对不同组织和器官中的基因表达进行比较分析，揭示基因的表达模式和调控机制。
NGS技术在肿瘤个体化治疗中的优势及局限性
NGS技术在肿瘤个体化治疗中的优势及局限性肿瘤个体化治疗是一种基于个体基因组信息的治疗策略，旨在根据不同患者的基因组特征，制定个体化的治疗方案，从而提高治疗效果。
随着高通量测序技术的不断进步，尤其是下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术的问世，肿瘤个体化治疗进入了一个新的时代。
本文将重点探讨NGS技术在肿瘤个体化治疗中的优势及局限性。
首先，NGS技术具有高通量的特点，能够快速、准确地测序大量的DNA或RNA序列。
相比传统的测序方法，NGS技术在样本处理、实验时间和经济成本上都有明显的优势。
通过大规模测序，可以同时检测多个基因的突变、融合、复制数变异等信息，为肿瘤个体化治疗提供了更多的生物学信息基础。
其次，NGS技术可以检测多种类型的变异。
除了已知的突变类型，如基因点突变、插入缺失等，NGS技术还可以检测到新的突变类型，如复杂结构变异、基因重排等。
这使得NGS技术在个体化治疗中能够更全面地了解肿瘤的基因组特征，从而更准确地制定治疗方案。
另外，NGS技术还可以通过分析肿瘤中的循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA），实现无创的肿瘤监测。
ctDNA是肿瘤细胞释放到血液中的DNA片段，可以通过血液样本进行测序分析。
通过监测ctDNA的变化，可以实时了解肿瘤的进展和治疗效果，并根据变化调整治疗方案，实现个体化的治疗。
然而，NGS技术在肿瘤个体化治疗中也存在一些局限性。
首先，NGS技术虽然能够高通量地测序基因组，但仍然受到测序深度和覆盖度的限制。
特别是对于样本中低频突变的检测，仍然存在一定的假阴性或假阳性的可能性。
因此，在解读NGS结果时需要结合临床病史和其他检测方法，进行综合分析。
其次，NGS技术在分析和解读大规模测序数据时需要复杂的生物信息学分析流程。
研究人员需要具备专业的生物信息学知识和数据处理能力，才能更好地解读和分析NGS结果。
基于NGS的肺癌组织基因检测与液体检测的一致性分析及对免疫治疗疗效的预测价值介绍演示培训课件
NGS技术可以检测肺癌患者血液中的肿瘤标志物，如癌胚抗原、细胞角蛋白19片段等 ，为肺癌的诊断和治疗提供重要信息。
液体活检
通过NGS技术对肺癌患者的血液、尿液等液体样本进行检测，可以实现肺癌的无创诊 断和实时监测，为患者提供更加便捷的检测方式。
NGS技术在两种检测中的比较
样本获取方式
NGS技术在免疫治疗疗效预测中的应用
NGS技术在肺癌基因检测中的应用
NGS技术可用于检测肺癌患者的基因突变、基因表达等，为免疫治疗提供个性化 的治疗建议。
NGS技术在免疫治疗疗效预测中的价值
通过NGS技术检测患者的基因变异等信息，可以预测患者对免疫治疗的反应，从 而为医生制定治疗方案提供参考。
NGS技术对免疫治疗疗效的预测结果和讨论
基于NGS的肺癌组织基因检测 与液体检测的一致性分析及对
免疫治疗疗效的预测价值
汇报人:XXX
2024-01-10
目
CONTENCT
录
• 引言 • 肺癌组织基因检测与液体检测概述 • NGS技术在肺癌组织基因检测和液
体检测中的应用 • 基于NGS的肺癌组织基因检测与液
体检测的一致性分析
目
CONTENCT
提取肺癌患者体液（如血液、尿液等）中的外泌体，检测其携带的蛋白
质、RNA等生物标志物，反映肿瘤的生物学特性。
组织基因检测与液体检测的比较
样本获取
组织基因检测需要获取肺癌组织样本，通常通过手术或穿刺活检获取；液体检测则通过抽 取患者外周血或其他体液进行检测，相对更便捷。
检测灵敏度与特异性
组织基因检测具有较高的灵敏度和特异性，能够直接反映肿瘤组织的基因组特征；液性相对较低。
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NGS技术对免疫治疗疗效的预测价值
肺癌精准治疗与转化研究新进展答案-2024年华医网继续教育
肺癌精准治疗与转化研究新进展答案2024年华医网继续教育目录一、早期肺癌的精细化诊疗和转化研究 (1)二、临床视角：IB期EGFR突变NSCLC的辅助治疗 (3)三、少见突变NSCLC治疗进展及思考 (7)四、抗体偶联药物在NSCLC中的运用 (9)五、肺癌局部介入消融治疗的应用——着眼局部，控制大局 (11)六、类器官在肺癌领域的研究和应用 (13)七、肺癌分子病理检测的指南与实践 (14)八、肺癌脑转移的研究现状 (16)九、恶性胸膜间皮瘤治疗新进展 (20)十、免疫时代的外科临床思考 (22)十一、免疫联合治疗的临床和转化研究 (24)十二、免疫治疗耐药机制和应对策略 (25)十三、免疫治疗生物标志物的探索 (27)一、早期肺癌的精细化诊疗和转化研究1.ctDNA甲基化相比突变的最大优势是？A.稳定B.数量大C.易分析D.分子小E.长度短参考答案：B2.肺癌辅助化疗提高多少5年生存率？A.0.05B.0.1C.0.15D.0.2E.0.25参考答案：A3.肺结节中恶性比例为？A.0.3B.0.2C.0.1D.0.05E.＜5%参考答案：E4.目前肺癌筛查的标准工具是？A.LDCTB.X rayC.CEA、cyfra21-1D.纤支镜E.PET-CT参考答案：A5.EGFR突变的术后辅助治疗首选？A.化疗B.放疗C.靶向治疗D.免疫治疗E.细胞治疗参考答案：C二、临床视角：IB期EGFR突变NSCLC的辅助治疗1.基于EVIDENCE研究，埃克替尼在国内获批适应症A.单药适用于IB-IIIA期EGFR突变NSCLC术后辅助治疗B.用于ⅠB-ⅢA期存在EGFR外显子19缺失或外显子21（L858R）突变的NSCLC术后辅助治疗C.单药可试用于治疗既往接受过至少一个化疗方案失败后的局部晚期或转移性NSCLCD.用于ⅠI-ⅢA期存在EGFR外显子19缺失或外显子21（L858R）突变的NSCLC术后辅助治疗E.单药适用于II-IIIA期EGFR突变NSCLC术后辅助治疗参考答案：E2.根据NCCN指南（2022年第5版），以下高危因素描述不正确的是A.低分化肿瘤（肺神经内分泌肿瘤[包括高分化神经内分泌肿瘤]）B.楔形切除C.脏层胸膜浸润D.肿瘤＞4cmE.淋巴结状态未知（Nx）参考答案：A3.关于I期NSCLC患者生存的影响因素，以下说法不正确的是A.与楔形切除术相比，肺叶切除术和肺段切除术在总生存率方面具有显著优势B.肺叶切除术和肺段切除术的3年或5年生存率存在显著差异C.肺叶切除术比亚肺叶切除患者有更好的生存D.对IB期患者肺叶切除后辅助化疗是更有效的治疗模式E.手术切除方式是影响I期NSCLC患者生存的最主要因素参考答案：B4.JACC第八版分期Ib期（T2aN0M0）患者的生存率约为A.77%B.68%C.53%-65%D.60%E.36%参考答案：B5.以下哪类患者可能不能从术后辅助化疗中获益A.肿瘤直径＜4cmB.IB期有高危因素的C.肿瘤直径≥4cmD.II期E.III期参考答案：A1.晚期NSCLC一线EGFR-TKI耐药后的治疗策略2.对于没有敏感突变基因突变的EGFR-TKI耐药患者来说，选择哪种治疗方式可能会获得较好疗效？A.铂类为基础的两药化疗B.抗血管治疗C.免疫治疗D.抗血管联合免疫E.免疫+化疗+抗血管参考答案：E3.下列哪两个基因突变可能会导致非小细胞肺癌向小细胞肺癌的转化？A.RB1和TP53B.RB1和C797SC.RB1和METD.RB1和RETE.RET和TP53参考答案：A4.目前市面可及的三代EGFR-TKI药物OS最长超过多长时间？A.2年B.3年C.2.5年D.4年E.5年参考答案：B5.对于EGFRmNSCLC患者使用奥希替尼治疗后出现T790M和C797S突变且为顺式模式，可以使用下列那种药物治疗？A.BrigatinibB.阿法替尼C.阿美替尼D.奥希替尼E.吉非替尼参考答案：A6.对于EGFRmNSCLC患者使用奥希替尼治疗后出现T790M和C797S突变且为反式模式，可以使用下列那种组合药物治疗？A.吉非替尼+埃克替尼B.吉非替尼+阿法替尼C.埃克替尼+达克替尼D.吉非替尼+奥希替尼E.阿美替尼+奥希替尼参考答案：D三、少见突变NSCLC治疗进展及思考1.治疗少见突变晚期NSCLC的抗肿瘤药物不包括以下哪种IB.双特异性抗体C.内分泌治疗药物D.ADCE.免疫检查点抑制剂参考答案：C2.以下叙述错误的是A.少见突变NSCLC围手术期靶向治疗的地位已确立B.不同TKI药物的耐药机制存在差异C.一种靶向药物可能可同时抑制不同的少见突变基因变异D.同一种驱动基因变异可在不同病理类型的实体瘤中发生E.以靶向少见突变的特异性抑制剂为主的联合治疗或可延缓耐药发参考答案：A3.以下描述错误的是A.液体活检相比于组织活检，具有克服肿瘤组织的异质性、样本可及性高、样本类型多、微创等优点，所以液体活检优于组织活检。
DDPCR的原理和应用
ddPCR的原理和应用1. ddPCR的基本概念ddPCR是数字PCR（Digital PCR）的缩写，是一种精确测量DNA或RNA分子丰度的方法。
与传统的PCR相比，ddPCR可以对目标分子进行数目的确定，而不是仅仅计算其相对含量。
2. ddPCR的工作原理ddPCR是通过将PCR反应分成大量的微小反应来进行的，每个微小反应中只有少量的目标模板分子。
这些微小反应分散在一个悬浮液中，并通过分配到大量的反应容器中来实现。
在PCR反应完成后，通过测量每个微小反应的阳性和阴性信号，可以准确计算出目标分子的绝对含量。
3. ddPCR的主要优势•高精确度：ddPCR可以提供更准确的目标分子的定量结果，尤其适用于高低丰度样本的分析。
•高灵敏度：由于将PCR反应分成小体积反应，ddPCR可以检测到非常低的目标分子丰度。
•抗干扰性强：ddPCR对杂交反应和抑制物具有较高的抗干扰能力，能够处理复杂的样本环境。
•无需标准曲线：ddPCR不需要依赖于标准曲线来确定目标分子的含量，因此可以节省分析时间和资源。
4. ddPCR的应用领域4.1 疾病诊断ddPCR在疾病诊断中的应用非常广泛。
通过检测患者样本中的特定DNA或RNA标记物的含量，可以快速、准确地诊断多种疾病，如癌症、感染性疾病等。
4.2 基因表达分析ddPCR可以用于研究基因表达的变化。
通过定量特定基因的mRNA水平，可以了解该基因在不同条件下的表达模式，进而揭示基因调控的机制。
4.3 微生物检测ddPCR能够检测微生物的存在和数量。
在食品安全和环境监测等领域，ddPCR 被广泛应用于微生物的检测和鉴定。
4.4 胚胎遗传学ddPCR可以进行胚胎遗传学检测，包括检测胚胎中的染色体异常、单基因病变等。
4.5 遗传变异研究ddPCR可用于研究个体之间的遗传变异。
通过检测特定基因的拷贝数变异、SNP等，可以了解个体之间的遗传差异与相关疾病的关系。
5. ddPCR的未来发展方向随着高通量测序技术的飞速发展，转录组学和基因组学的大数据分析成为了研究的主要方向之一。
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ddPCR血液 已知
难（已知） 已知 已知 好 已知
难（已知） 已知
NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类
• MET 14 exon skipping，HER2 20 exon insertion等情况复杂的突变 • EGFR等热点基因的非热点突变位点 • ALK等热点基因的非常见融合方式 • 罕见的EGFR-19Del 可能会造成PCR方法假阴性
NGS能够发现新的耐药机制
发现AZD9291获得性耐药机制---C797S突变
15例患者一代TKI进展， T790M+，应用
AZD9291后耐药，经检 测发现三种类型：
6例出现C797S 5例仍保持T790M，无 C797S T790M消失
Thress KS et al, Nat Med.2015 Jun;21
有研究发现T790M和C797S突变分子顺式/分子反式信息影响EGFR TKI治疗疗效； NGS和ddPCR都能够提供EGFR突变的in cis/in tran信息，具有重要的临床意义， 传统PCR检测则会遗漏这一信息；
K.S. Thress, et al. Nat Med, 2015. 21(6): p. 560-562.
在肿瘤克隆进化的过程 中，劳拉替尼耐药相关 亚克隆L1198F重拾对克 唑替尼的敏感性
Shaw AT et al, N Engl J Med. 2016;374(1):54-61. Bordi P et al, N Engl J Med. 2016;374(18):1790.
全外显子测序结果有助于评估接受免疫治疗的患者预后
• 等位基因突变频率=4/14=28.5% • 未突变的DNA来自正常组织或肿瘤中的其他亚克隆
EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
N. Rizvi et al, Science, vol 348, 2015
基于NGS的血液DNA甲基化检测能够满足肺癌 早诊的需求
Delpu et al. Int. J. Mol. Sci. (2013) PNAS
感谢聆听
与EGFR不同ALK-TKI的耐药机制更加复杂
• NGS检测EGFR和ALK的耐 药位点都没有问题。
• ddPCR只能做T790M这种 比较集中出现的耐药位点 检测。
随着建库技术和生物信息分析策略的进步NGS液体 活检敏感性已经远超ddPCR
NGS检测能够帮助分析肿瘤克隆的进化
评论：相比反复活检 在临床面临的巨大挑 战，ctDNA动态随访 是对肿瘤克隆进化监 控的最佳方式
• 1987年，KRAS基因突变在当时50%的肺腺癌患者中被发现。 • 2004年，EGFR突变作为新的肺腺癌驱动基因被发现。 • 2014年，随着TCGA计划的完成，肺腺癌的基因突变图谱被进一步完善。
NGS在肿瘤临床领域的应用
组织
遗传易感性 伴随诊断用药指导
良恶性判断 复发与疾病进展监控
早期筛查
NGS与ddPCR在肺癌8基因检测对比
NGS组织
NGS血液
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
可以
难
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
ddPCR组织 已知 已知 已知 已知 很好 已知 已知 已知
新分子检测技术在肺癌精准治疗中的应用
NGS与ddPCR比较
测序技术的发展带来靶向治疗的纵深研究
Li TH, et al. J Clin Oncol 31:1039-1049
对NSCLC驱动基因的认知随着分子检测技术 的进步在不断深入
Ashley J. Vargas et al，Nature Reviews Cancer 16, 525–537 (2016)
约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合， 但有1/4为与其他基因的融合，包括：
• STRN-ALK • CATSPERB-ALK • ACVR1-ALK • CLIP1-ALK • DPH6-AS1-ALK • KIF5B-ALK • RP11-320M2.1-ALK • UGP2-ALK
基于靶向捕获的NGS能够同时检测已知突变 和未知突变
ddPCR
热点1
Capture NGS
检测基因
热点2
热点3
热点4
NCCN指南建议初诊患者进行多靶点平行检测
针对非小细胞肺癌的8个基因NGS可以完全覆盖
检测基因型 EGFR突变 ALK融合 HER2突变 BRAF突变 MET扩增 MET14外显子跳读 ROS1融合 KRAS突变血液ຫໍສະໝຸດ NGS在肺癌临床领域的应用
非小细胞肺癌
遗传易感性
伴随诊断用药指导
NGS + ddPCR
良恶性或分子分型
复发与疾病进展监控 NGS + ddPCR
早期筛查
NGS
肿瘤的异质性对传统分子组织诊断提出了挑战
NGS和ddPCR都能够报告等位基因突变频率， 反映不同亚克隆的比例关系
NGS和ddPCR都是通过计算，看检测出多少带有突变的DNA（突变型），和检测 到的所有的DNA（野生型+突变型）的比值来确定等位基因突变频率（AF）。