PCR引物设计的基本原则

PCR引物设计的基本原则

1. 引物的长度一般取15-30bp，常用18-27bp，但不能大于38bp，因为引物过长会导致其延伸温度大于74℃。

2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也很可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好处于72℃左右。（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55-80℃之间

5. ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是0~-2 kcal/mol时，PCR产量几乎到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%、到-8时少于20%、而-10时接近于0。

6.错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但是对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；

7. Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。

8. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG为-3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

9. 以公式（4×G/C + 2×A/T-5）计算Tm值，即退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应得的退火温度。4-6℃的差别似乎对PCR产量影响不大。保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内。

10、模板与稳定性较小引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率月高。因为解链温度也取决于它的的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；

11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT 含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；

12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。

13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。