微生物工程

微生物工程

一.名词说明

微生物工程：指采纳现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直截了当把微生物应用于工业生产过程的一种技术。

拮抗作用：当多种物质联合作用时，其中的一种物质会通过一定渠道降低另一种物质的作用〔通常是有害作用〕，使机体坚持平稳状态。例如当人体血糖含量较高时，胰岛素分泌增加，胰高血糖素分泌减少，两种激素桔抗作用使血糖的含量降低。当血糖含量较低时，胰岛素分泌减少，胰高血糖素分泌增加，结果是使血糖的含量升高。

生物测定：利用某些生物对某些物质(如维生素、氨基酸)的专门需要，或对某些物质(如激素、抗生素、药物等)的专门反应来定性、定量测定这些物质的方法。载体：能够插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳固的自我复制的核酸分子。

质粒：细胞中独立于染色体之外，能够独立复制的共价闭合环状DNA.

菌落原位杂交：是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与放射性同位素标记过的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。效价：抗生素的计量单位，是抗生素等生物制品有效成分含量高低的指标，能够通过仪器的方法测得。

复制起始位点：指在DNA转录时RNA聚合酶与之结合，起始转录的特定核苷酸序列，决定转录起始位点和转录频率。

BOD〔生物需氧量〕：通常表示水中有机物等需氧污染物质含量的一个综合指示。水中有机物由于微生物的生化作用进行氧化分解，使之无机化或气体化时所消耗水中溶解氧的总数量。

半连续发酵：指在发酵过程的后期周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新奇培养基的发酵方法。这种发酵能够重复多次。

半连续发酵semi-continuous fermentation：是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。

补充发酵：指在发酵过程中以一定的速率排出成熟的发酵液，同时以相同的速率加入新奇培养基，使整个发酵过程差不多坚持在稳固期的发酵方法。抗生素：是由微生物〔包括细菌、真菌、放线菌属〕或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。

下游处理：特指生物工程产品生产程序中的后期加工。指的是生物产品专门是发酵液的分离、纯化、加工、剂型制备等，直至达到产品质量要求的整个处理过程。

二.简答题

1.基因工程在微生物工程的应用表现在哪些方面？每一方面举例1-2个说明。答：①生产药物疫苗中的引用：这类基因工程药物的生产是当前基因工程最重要的应用领域，进展迅速。例如：有抗肿瘤.抗病毒功能干扰素.白细胞等；用于生理调剂的胰岛素和其他生长激素等。

②改造传统工业发酵菌种：例如生产抗生素.氨基酸.有机酸.酶制剂等，这类菌种差不多上都要通过长期的诱变或重组育种，生产性能专门难再大幅度的提高。要打破这一局面，必须使用基因工程的手段才能解决。目前在氨基酸.酶制剂等领域已有大量成功的例子。

③环境爱护：在环境爱护方面，利用基因工程可培养同时能分解多种有毒物质的遗传工程菌。如：1975年，有人把降解芳烃，萜烃和多环芳烃的质粒转移到能降解Pesudomonas.sp〔一种假单胞菌〕中，获得了能同时降解4种烃类的‘超级菌’，它能把原油2/3的烃分解掉。

2.作为基因工程载体系统，其载体需要具备哪些条件？

答：载体：外源DNA不易进入受体细胞，他需要与某种工具重组后才能导入宿主细胞，以进行克隆和储存或者表达外源DNA中的遗传信息。这种将外源DNA 携带进受体细胞的工具称为载体。理想的载体应具备以下几个条件：①能稳固复制，目的基因的插入差不多不阻碍载体的复制能力；②应具有一个以上的单一限制酶位点，以便目的基因的插入；③具有某些容易检测的遗传标记，以便利用这些标记选择克隆；④插入目的基因的幅度较宽；⑤分力量小，拷贝数高；⑥从生物防护角度考虑是安全的。

3.质粒构建的策略要考虑哪些方面。

答：〔1〕构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制，同时作为质粒克隆载体，期望在受体细胞中有较多的拷贝数。为此，构建的质粒克隆载体必须含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点〔ori〕，最好是放松型质粒的复制起始位点。

〔2构建的质粒克隆载体必须含有承诺外源DNA片段克隆的位点，同时如此的克隆位点应尽可能多。

〔3〕构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。一个质粒克隆载体最好有两种选择标记基因，同时在选择标记基因区内有合适的克隆位点。当外源DNA片段插入克隆位点后，标记基因失活，成为选择克隆子的依据。

〔4〕构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能的小。由于质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA分子大小相关，小分子质粒的转化效率高，大于15kb的质粒

转化效率明显下降。质粒克隆载体DNA分子小，意味着可承载较大的外源DNA 片段。

〔5〕依照专门需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种〝元件〞〔小DNA片段〕，构建成不同用途的质粒克隆载体。

4.目的基因的检测与鉴定要开展哪些方面着手？简述之。

答：①耐药性标志筛选择〔插入失活法〕：假如克隆载体携带耐药性标志基因，转化后只有含有耐药基因的转化子细菌才能在含有该抗生素的培养基上面形成菌落，如此能够将转化菌与非转化菌区别开来。假如重组DNA的外源基因插入基因内，标志基因失活。

②标志补救：假如克隆基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么久能够利用营养突变菌株进行选择，这确实是标志补救。

③分子杂交法：这是利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直截了当选择并鉴定目的基因。

④PCR选择法：依照目的基因两端核苷酸序列设计合成一对引物，依据实验目的的与要求的不同，快速抽提宿主细胞质粒DNA或染色体DNA作为模板进行PCR扩增反应，将扩增反应产物进行凝胶电泳分析，假设显现特异片段的扩增条带，即说明该克隆为阳性克隆。

⑤免疫学方法：假如克隆基因的蛋白产物的，可利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行选择，因此属非直截了当选择法。

⑥DNA序列分析法：对DNA分子序列鉴定是验证外源基因是否正确的最确凿证据。

5.限制性核酸内切酶的类型有哪些？各有何要紧特点。

答：限制性核酸内切酶是能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型、第二型及第三型。

第一型限制酶：兼具限制切割和修饰两种功能，然而识别位点并非严格专一，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做为催化反应的辅因子，在讲解DNA时，伴有ATP的水解。

第二型限制酶：其限制-修复系统由一对酶〔同一序列的限制酶和甲基化酶〕组成，分子量较小，仅需要Mg2+做为辅因子，不需要ATP，识别位点专一，并在识别位点内讲单链切断。因此二型限制酶在基因工程应用广泛，通常说的限制酶确实是Ⅱ型酶。

第三型限制酶：兼具限制切割和修饰两种功能，识别位点专一，然而切点不专一，往往不在识别位点内部，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做为催化反应的辅因子，在讲解DNA相伴ATP水解。

6.在基因工程中，以细菌转化为例，说明其转化的原理和技术？