药学分子生物学

第一章基因与基因组

基因 (gene) ：是指合成有功能的蛋白质、多肽或RNA所需的全部DNA序列（除部分病毒RNA），是基因组的一个功能单位。

基因组（genome）：是指生物体一套完整的单倍体遗传信息的总和，包括所有基因和基因间的区域。

基因组的主要功能是贮存和表达遗传信息，是物种及其个体之间区别和联系的最本质生物学特征。

基因组学（genomics）：是研究生物基因组的结构、功能及表达调控的一门科学。

调控序列（顺式作用元件）：一个基因的调控区和其结构基因位于同一个DNA分子的相邻部位，这种调节方式称为顺式调节，相应的DNA序列成为顺式作用元件。

（1）启动子：RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。（2）增强子：能强化转录起始的一段DNA序列。（3）沉默子（4）终止子。

反式作用因子：通过识别或结合顺式作用元件上的核心序列从而参与调控基因转录的蛋白质。也称转录因子。

原核生物基因组结构特点:

1. 具有类核结构

2. 以操纵子为功能单位/多顺反子mRNA

3. 结构基因大多为单拷贝，编码序列一般不重叠

4. 结构基因大多没有内含子

5. 非编码序列比例约为一半

6. 含可移动 DNA 序列

操纵子（operon）

⏹操纵子是原核生物的一段DNA序列，由几个串联排列的功能相关的结构基因，加上

调节序列组成的一个完整的连续的功能单位。

⏹操纵子结构通常与启动子区域有部分重叠，可通过代谢物与调节蛋白相互作用而激

活或抑制基因转录，这是原核生物最常见的转录调节方式。

真核生物基因组结构特点

1. 基因组庞大，为线状双链DNA

2. 断裂基因

3. 非编码区与单顺反子

4. 大量重复序列

5. 基因家族与假基因

断裂基因（split gene）:真核生物结构基因由外显子与内含子间隔排列，内含子在转录后被剪切掉。

基因家族（multi gene family）：是来源相同，结构相似，功能相关的一组基因，由某一共同祖先基因经重复和突变产生。

假基因（pseudogene）：与具正常功能基因序列相似，但无转录功能或其转录产物无功能的基因。

人类基因组计划（HGP）

HGP的主要目标:

•遗传图谱：基因或DNA标记在染色体的相对位置与遗传距离。

•物理图谱：一级结构上两个DNA片段之间的实际距离。

•序列图谱：基因组DNA的全部核苷酸序列。

•转录图谱：正常或受控条件全基因表达的时空图。

HGP的意义:

•鉴定人类全部基因，推动生物技术发展。

•理解疾病与基因的关系。

•推动模式生物研究。

•促进多学科发展与交叉融合。

不同生物基因组结构特点：

蛋白质组学（proteomics）：阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。

第二章 PCR、核酸杂交、基因芯片

PCR基本原理：以待扩增的DNA为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为底物，按照半保留复制的原理，通过变性、退火、延伸三个步骤完成新的DNA合成，并反复重复这一过程。

PCR反应步骤：

高温变性：94℃获单链模板

低温退火：55℃引物结合单链模板

适温延伸：72℃ DNA新链合成

PCR反应体系：DNA 模板、引物（决定PCR反应特异性）、耐热DNA聚合酶、dNTP、缓冲体系一、二价阳离子

PCR与DNA复制的比较：

相同点：

⏹DNA合成反应

⏹DNA聚合酶参与

⏹需要引物

⏹4种dNTP为原料

不同点：

⏹体外反应

⏹仅合成特定DNA片段（由1对引物限定）

⏹变温条件下进行

⏹仅一种耐热的DNA聚合酶参与

⏹DNA引物

⏹循环多次

PCR反应体系的优化：特异性、有效性、忠实性

1、DNA聚合酶：耐高温、保真性、激活剂

2、模板DNA：种类、用量、质量

3、dNTP: 浓度一致、稳定

4、DNA引物：决定PCR扩增产物的特异性和长度。

引物设计一般遵循的原则：长度；碱基随机分布；避免引物间、引物自身互补；引物的3’端不能修饰、不应错配；两条引物之间退火温度不大于5 oC。

PCR技术的应用

1) 基因克隆

2) 基因检测

(1) PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)

基因突变会导致基因序列中产生新的限制性核酸内切酶位点或使原有限制性核酸内切酶位点消失。

因此，突变基因经相应的限制性核酸内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在，即限制性片段长度多态性技术。

(2) PCR产物的单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)

❑基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA由于碱基组成或排列顺序不同，形成不同的构象。

❑利用PCR扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成单链DNA片段构象的改变，其迁移率随之改变，从而检测基因的突变。

(3) PCR产物的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交 (PCR-ASO)

采用PCR扩增受检者基因的目标片段，并与相应的ASO探针杂交。

针对已知突变位点的基因，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针（N），与正常序列互补，另一个为突变型探针（M），突变碱基应位于探针的中央，与突变序列互补。PCR衍生技术

（一）巢式PCR

（二）逆转录PCR (RT-PCR)

先将RNA用反转录酶反转录成cDNA，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与普通PCR类似。

反转录酶：AMV和MoMLV反转录酶

反转录引物：随机引物、Oligo (dT)、特异性引物

用途：检测基因表达水平；检测RNA病毒

（三）多重PCR

在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段的方法。

优点：多个致病基因同时检测。

（四）定量PCR

实时荧光定量PCR

在PCR反应体系中加入反应PCR扩增进程的荧光染料或荧光标记探针，实时监测PCR过程中荧光信号的变化，通过参照基因或标准曲线对起始模板DNA的浓度进行精确定量分析。

实时荧光定量PCR原理

❑如何对起始模板定量？

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

❑三个基本概念：

扩增曲线、荧光阈值、Ct值

扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；

纵坐标：荧光强度

❑荧光染料：SYBR Green I

核酸分子杂交

原理：核酸变性与复性

核酸分子杂交技术

用标记的已知序列的核酸片段（探针）来检测样品中未知核酸序列（形成异源杂交体），再经显影或显色的方法，将结合的核酸的位置或大小显示出来。

核酸探针（probe）

能与待测的靶核酸序列特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核酸片段。

核酸探针类型

❑DNA探针：基因组DNA探针；cDNA探针；寡核苷酸探针