病毒学实验

实验一病毒对细胞的感染

目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。

材料：杆状病毒Sf9细胞

器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器

步骤：

1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；

2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；

3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照；

4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。

实验二病毒的扩增与收集

目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。材料：杆状病毒Sf9细胞

器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器

步骤：

1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；

2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；

3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；

4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况；

5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管；

6、4℃，12000rpm,10min，取上清；

7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃.

实验三病毒的敏感性测定

目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。

材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿

器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅

步骤：

1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）；

2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，

混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取下层备用；同样，取等量病毒不加乙醚于4℃同样处理备用（空白对照）；

3、高温预处理：取一定量病毒悬液于55℃处理30min后备用；同样，取等量病毒于4℃处理30min备用（空白对照）；

4、分别取适量经氯仿、乙醚、高温处理及未处理的病毒悬液感染Sf9细胞；

5、28℃培养24-48h，对照观察细胞感染效率。

实验四病毒的效价测定--血凝实验

目的：某些病毒如流感病毒可以结合红血细胞而使得红血细胞凝集，因此而判断病毒的有无和进行粗略定量。通过该实验以掌握血凝实验的操作技术，并理解及应用原理。

材料：仙台病毒公鸡红血细胞（新鲜）生理盐水

器材：96孔板培养箱微量取样器

步骤：

1、于96孔板中选择一排孔，自第1孔至第12孔各加25uL生理盐水；

2、在第1孔中再加入25uL仙台病毒原液，混匀，然后吸25uL 至第2孔，混匀，然后吸25uL至第3孔，混匀；依次倍比稀释，至第11孔，吸弃25uL；于是得到病毒的稀释比例依次为1:2，1:4，1:8……。最后的第12孔为对照。

3、于第1至第12孔中依次再补加25uL生理盐水，混匀；

4、于第1至第12孔中依次加入25uL1%鸡红血细胞悬液，充分混匀；

5、25-37℃静置30-60min，观察红血细胞的凝集情况；

6、结果判定：以100%凝集的病毒最高稀释度为该病毒的血凝价，即一个血凝单位。不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。