(整理)基因操作原理

（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考）第一章编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。

Include:1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame)2.保证转录所必须的调控序列(S-D)3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer)4.内含子(intron)Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。

两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。

上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。

Development of gene engineering：第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程第二章目的基因的获得（DNA的准备）1.从基因组直接获得2.RT-PCR 方法获得3.人工合成法DNA抽提的基本原理•1 获得细胞，裂解细胞三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。

非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。

在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。

2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离）3 纯化（去除RNA）•RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。

3 纯化（去除蛋白）•常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。

PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右How many copies?1.到第3个循环才有目的片断（指用长DNA作为模板）.2.早期并不严格按2倍增长3.30 循环时约有1,073,741,764 个目的产物(~1×109).4. 有约60 不是目的长度的片断.5.大于35 个循环时不能明显增加产物量进入平台期的原因:1.反应试剂用完2.产物之间相互退火3. Taq酶活性降低优化PCR反应：1.引物的退火温度.2.Mg2+ 的浓度.3. 延伸时间.4.模板和Taq的量能否扩增RNA?• Not directly — the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. • mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase.• cDNA is a template for PCR — it need not be double-stranded.TA 克隆：1.Taq扩增PCR产物物末端加个A；2.可以与末端为T的载体直接连接引物设计要求：引物长度在20个碱基左右；.引物G/C 含量约 45–55%；2条引物退火温度差别不要超过1°C；引物内部最好没有反相互补序列；2条引物之间不能有互补序列；引物内部不能有重复序列。

PCR存在的问题：1 . 可信度（ F i d e l i t y ）： P C R 反应过程中的错配现象，给PCR克隆、变异导入带来麻烦。

2.扩增的DNA长度：一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。

3.扩增的DNA量：对有些检测、克隆时，DNA量往往达不到要求。

4. PCR扩增困难：当DNA富含GC或具有复杂二级结构时，PCR很难扩增。

5.PCR反应速度：当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。

2-3 分子杂交1 Southern Blotting2 Northern Blotting3 Western Blotting（一）Southern Blot 基因组DNA与DNA探针的杂交功能：1 研究某一基因在基因组中的拷贝数2 研究异源物种是否有类似基因（ZooBlooting）•原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

Southern Blot Southern Blot 操作步骤：DNA →琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色二、Northern Blooting RNA与DNA探针的杂交功能：1 分析mRNA的分子量大小 2 分析mRNA表达量3 分析mRNA表达的组织分布4 分析mRNA的发育表达化5 研究mRNA的不同剪切方式Northern blot的步骤：•1 RNA电泳（包括制备变性胶和RNA样品的处理）•2 转膜（把RNA从胶上转移到膜上）•3 杂交（用标记同位素的DNA探针与膜进行杂交）杂交前一般要进行预杂交，消除非特异性杂交•4 洗膜、曝光、冲片三、Western Blot 蛋白与蛋白的杂交，如蛋白与抗体的杂交功能：1 分析蛋白的分子量大小 2 分析蛋白表达量3 分析蛋白表达的组织分布4 分析蛋白的发育表达变化5 研究蛋白前体的后加工方式WesternBlot原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

ELISA原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml 水平），并且重复性好。

类型：（1）间接法测抗体(2) 双抗体夹心法测抗原(3)竞争法测抗原cDNA法克隆目的基因的基本策略双链cDNA的克隆双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：1.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，分子可这样重组通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收cDNA法克隆目的基因的局限性：1.并非所有的mRNA分子都具有polyA结构2.细菌或原核生物的mRNA半衰期很短3.m RNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难4.仅限于克隆蛋白质编码基因第3章基因工程酶的操作限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。

限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。

如EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：I、II、III型。

他们在酶反应中所需要的辅因子和切割DNA的位点都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。

II型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构,或称回文序列(Palindromic Sequence)大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个核苷酸。

识别长度决定了剪切DNA的频率（1/4n，n为识别的长度）。

识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性高。

限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构切割位点专一作为工具酶的限制性内切酶有固定的切割位点；产物具有特定的末端结构当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。

即一种限制性内切酶切割任何DNA只产生一种固定形式的末端结构，在DNA连接酶的作用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的DNA分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。

任何一种限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸3’、5’-磷酸双酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’为游离羟基。

由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构①平末端（Blunt End）指酶切片段为齐头末端结构。

②粘性末端（Cohesive End）酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基长度的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补的序列。

粘性末端又可分为5‘-粘性末端与3’-粘性末同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。

这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

酶反应条件按手册或商品说明书反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。