小肽检测方法

肽含量检测方法—三氯乙酸沉淀法（TCA-NSI）

（可溶解小分子含氮物质定量测定）

检测项目检测方法

三氯乙酸氮溶指数的测定一．仪器设备

1.实验室用样品粉碎机或研钵

2. 分析筛：孔径0.45mm（40目）

3. 分析天平：感量0.0001g

4. 消煮炉或电炉

5. 滴定管：酸式，10、25mL

6. 消煮管：250mL。

7. 凯氏烧瓶：250mL 8．离心管

9．凯氏蒸馏装置：半微量凯氏定氮装置

10．锥形瓶：150、250mL11．容量瓶：100mL

12．烧杯：250 mL

13．台式离心机：定时，调速，转速可达4000 转/分

14．普通磁力搅拌器15．移液管：25 mL

16．称样皿：

17．电热式恒温烘箱：可控制温度为105±2 ℃

二．试剂

1. 硫酸：化学纯，含量为98％，无氮；

2．混合催化剂：0.4g 五水硫酸铜，6g硫酸钾，均为化学纯，磨碎混匀；

3．氢氧化钠：化学纯，40％水溶液（m/V）；

4．硼酸（GB 628）：化学纯，4％水溶液（m/V）；

5．混合指示剂：甲基红％乙醇溶液，溴甲酚绿％乙醇溶液，两溶液等体积混合；

6．盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB 601制备；

盐酸标准溶液：C（HCl）=L。盐酸（GB622，分析纯），注入1000mL 蒸馏水中

7．硫酸铵：分析纯，干燥；

8．三氯乙酸：分析纯，10％水溶液（m/V）。

9．蔗糖（HG3-1001）：分析纯

三氯乙酸氮溶指数的测定三．操作方法

1.取称样皿一只， 250mL烧杯一只，离心试管六只，洗净后置于烘箱中备用。

2.粉碎研磨，全部过40目筛，取筛下物约5克置于称样皿中，在105℃的温度下

烘干3h，取出，盖好称样皿盖，在干燥器中冷却30min，称重。再同样烘干1h, 冷却，称重，直至两次重量之差小于0.002g为恒重。

3.称取恒重后的样品m1克（注：样品约2至3克），置于烧杯中，加蒸馏水75mL，

室温下电磁搅拌45分钟。将烧杯中溶液及沉淀摇匀，折入离心试管中，离心后收集上清液（1号上清液）。

注：离心转速2500转/分钟，离心时间10分钟。

4．取1号上清夜25mL，加入25mL10%的三氯乙酸溶液，混合后静置20分钟。将烧杯中溶液及沉淀摇匀，折入离心试管中，离心后收集上清液（2号上清液）。

注：离心转速4000转/分钟，离心时间20分钟。

5．取2号上清液25mL，小心移入干燥的500mL凯氏烧瓶中，加入混合催化剂6.4g，再加入12mL浓硫酸和数粒玻璃珠，摇匀，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强火力，直至呈透明的蓝绿色，然后继续加热，至少2h.。待试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转人100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。安装好半微量蒸馏装置后，向接收瓶内加入20mL硼酸吸收液及2滴混合指示剂，并使冷凝管下端插入吸收液内，蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10mL注人蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加入密封，防止漏气。蒸馏5min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

6．蒸馏后的吸收液立即用L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。得消耗盐酸标液V1（mL），滴定的结果用空白实验校正。

7．另称取样品m2克（约至1克），用步骤5相同的方法定氮，得消耗盐酸标液V2（mL），滴定的结果用空白实验校正。

三氯乙酸氮溶指数的测定四．计算公式

1．三氯乙酸氮溶指数（TCA-NSI）按式（1）计算：

TCA-NSI（%）=（（V1-V0）×m2×75）/（（V2-V0）×m1×）×100 (1)

式中：m1---测定可溶性氮时称取的试样质量，g;

m2---测定总氮时称取的试样质量，g;

V0---空白试验消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL;

V1---测定可溶性氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL;

V2---测定总氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL;

2．允许误差

每个试样取两平行样进行测定，以算术平均值为结果。两次平行测定结果绝对差值不大于3%。

备注产品检测前提条件：不含非蛋白氮、游离氨基酸《3%。得到三氯乙酸氮溶指数才精确。

质量部技术总监总经理

一．关于富力肽中小肽含量的确定：

1．1 检测方法：三氯乙酸氮溶指数（TCA—NSI）

1．2 原理：

三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉定蛋白质和较长的肽段。随着酶解反应的进行，蛋白质的肽链逐渐被切成大小不等的片段，三氯乙酸氮溶指数提高。因此，三氯乙酸氮溶指数可以准确地反应蛋白质的酶解情况，溶解指数越高，表明小肽的含量越高。

1．3 方法：

见标准。

1．4 富力肽中小肽含量的确定：

采用上述方法进行检测，可以确定富力肽中的小肽含量。

在富力肽的全部蛋白类物质中小肽的含量为≥65%。

在富力肽的水溶性蛋白类物质中小肽的含量为≥98%。二．关于富力肽中小肽分子量谱的确定：

2．1 检测方法：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱

（MALDI—TOF—Mass Spectroscopy）

2．2 原理：

质谱是肽和蛋白质分析的重要工具，这主要归功于一些软电离技术的应用，其中最具代表性的即基质辅助激光解吸附电离（MALDI）。该项技术由于方便、灵敏度高，已成为蛋白质酶解产物中肽段质量谱分析（Peptide Mass Fingerprinting）的最有效