组织制片技术概述

1.溶媒：水和乙醇。
2.浓度：低浓度，长时间。 3. 温度：高，染色效果明显。 4. 适当使用媒染剂、促染剂和分化剂。 媒染剂：能增强染料对组织的着色能力，其本身与染料或组织 不发生结合的试剂。如配制各种苏木精染色液时添加的钾明矾 、铵明矾等。 促染剂：能增强染料对组织的着色能力，本身并不参与染色反 应。如伊红染色液中添加的冰乙酸等。 分化剂：能除去组织上和切片上过染的染色液，使染色部位与 周围组织对比鲜明，着色深浅适当；例如低浓度的盐酸、醋酸 、高锰酸钾、重铬酸钾等。
• 取材手术器械锋利规范操作，防止组织损害 • 注意取材环境和器械干净，防止组织污染
固定和固定后处理
一、固定的目的 ：
固定剂使细胞的成分凝固，防止组织细胞 自溶和腐败，保持细胞生活时的状态。 固定剂的酶染作用使细胞各成分易于被染 料着色。
使组织适度硬化，利于制作薄片。
二、固定的方法：
1. 直接固定：最常用。
定要求。
四、常用固定剂
单纯固定剂 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重铬 酸钾、丙酮、 铬酸、四氧化锇 固定组织时，只单用某一种试剂尚难对各种组 织成分有较理想的固定作用。因此，常加入其它试 剂，根据对组织的作用与反应，配成混合固定剂， 以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。 混合固定剂 4%多聚甲醛液、乙醇—甲醛液、 Bouin氏液、 苦味酸—硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液
组织切片法
利用化学试剂将组织经过一系列的固定、脱 水、透明后，再利用石蜡、火棉胶或者明胶等支 持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度， 并包埋成块，然后依靠切片机将包埋好的组织块 切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色
得到的供显微镜下观察的标本的方法。
组织切片法的种类
冰冻切片 石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片
5.
6.
组织漂白 ：锇酸固定的组织为黑色。漂白液漂白 才上色。
脱钙：含钙组织骨、牙齿和内耳。
脱
一、脱水
水
用某种能与透明剂互溶的化学试剂将组织内 的水分逐渐置换出来的过程。 要点：缓慢、彻底、勿过度。 二、常用脱水剂 乙醇、丙酮、正丁醇
乙醇
•固定剂 + 脱水剂
•上行酒精脱水
•70%（30%）→100%，以10％递增。
二甲苯
•为无色透明的液体，易挥发，长期接触对呼吸道粘膜 有较强的刺激作用 •20分钟—1个小时，大块组织可适当延长时间。 •作用迅速，浸泡时间过长易发生过度收缩和脆化
苯甲酸甲脂
•为无色透明的液体，易挥发 •透明作用较二甲苯缓慢，透明时间12--24小时。 •对组织块的收缩和脆化的影响较小。 •苯甲酸甲脂与火棉胶互溶，用于火棉胶切片的透明
含量。来自百度文库
组织制片是研究医学和生物学的一个最基本的手段。
组织制片技术的方法
非组织切片法 组织切片法
非组织切片法
组织不经过切片制成观察标本的方法。
非组织切片法的种类
涂片、压片、铺片、磨片、消化分离标本、 活体标本、整装标本、血管注射标本。
• 涂片
将所采的血液、骨髓或者脱落细胞涂抹于
载玻片上经瑞氏、姬姆萨染色、常规HE染色。
能被碱性染料着色的物质：嗜碱性(basophilia)； 能被酸性染料着色的物质：嗜酸性(acidophilia)。
物理反应 细胞中有许多微小的毛细小孔，染料的 色素离子通过这些小孔渗入细胞内，染料与细胞 没有牢固的结合，但分散的色素离子和组织细胞 分子之间通过分子间相互作用使细胞着色。
三、染色的注意事项：
冰冻切片
• 将所取材的新鲜组织，经 快速冷冻后再切片，以保 持组织内所含的脂类或某 些酶类的活性。 • 为观察急待结果的组织， 如临床手术所取组织
石蜡组织切片标本制作的基本程序:
1. 取材 → 2. 固定和固定后处理 → 3. 脱水
→ 4. 透明 → 5. 浸蜡与包埋 → 6. 切片 →
7. 染色→ 8. 封固
根据器官组织的结构特点选择取材时切面的方向
肾脏—肾门处作纵切 头皮—顺毛根的方向纵切 大小肠的环行皱襞—纵切 气管和食管—横切
三、取材时应注意的问题 ：
• 组织新鲜：取材动作快捷，迅速投入固定液
• 注意环境温度的影响：冰上取材或者冷固定
• 材料应小而薄： 不超过1.5×1.5 × 0.5cm3
• 固定液会造成组织收缩，注意保持组织原有形态
封
一、封固
固
最后一道程序是滴加封固剂，用盖玻片覆盖，
以利于镜下观察。 阻断组织片与外界的接触，防止组织片脱片、 受潮、干裂、机械磨损等，延长切片的使用时间。 这一步骤称为封固。
封固分为干封和湿封两种。
干封：切片染色经脱水和透明后，用中性树胶之 类无水封固剂封固。数年不褪色。
染色就是染料和组织细胞的分子相互结合，使组织和 细胞着色。 化学反应 在组织细胞内含有酸性物质和碱性物质。染 色时酸性物质与碱性染料结合；碱性物质与酸性染料结合。 细胞核中主要由酸性物质组成（如核酸等），所以与苏木 精等碱性染料有很强的亲和力。细胞质主要由碱性物质组
成，所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力。
染
一、染料
色
指分子中含有发色团和助色团的有机化合物，有鲜
艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。 根据来源可分为两类：
天然染料（卡红、苏木精）
人工合成染料（苦味酸、桔黄G） 根据其化学性质分为： 碱性染料(basic dye) 酸性染料(acid dye)
中性(neutrophilia)染料等
二、染色的原理
然后再进行染色封固在载玻片上。
消化分离标本：先将组织分离成小块，然后利用
相应的化学物质将细胞间质消化溶解，再用机械
分离的方法，如水的震荡冲击力，使小块组织分
离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片 上进行封固。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动 神经细胞等。
活体标本 将所采的观察标本加生理盐水后直接 滴于载玻片上在显微镜下观察：微生物运动
二、取材的步骤
1. 选择动物
2. 选择取材部位
3. 选择切面方向
应根据实验工作的目的和经济能力选择实验动物 肝脏—猪肝 卵巢—猫 胃 —狗
运动终板—爬虫类动物
肥大细胞—大、小白鼠的皮下组织
间皮和内皮—蛙的肠系膜
根据器官组织的结构特点选择取材部位 胰腺—胰尾部 脊髓的运动神经元—颈膨大和腰膨大处 肺 —肺门 胃—胃底部
整装标本 ①将胚胎或小动物经前期固定后整体 封藏于盛满固定剂的透明容器中 。②将发育至某一 阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明 后封固于载玻片上的标本。
血管注射标本 ①将有色物质注射进血管，用酸 或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血 管标本。 ②将有色物质注射进血管后，经一系列制 片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标 本。
•固定浓度： •固定时间： •配制方法： 80%--90%乙醇液 一般4小时—12小时 无水乙醇 + 蒸馏水
•固定后处理： 直接入脱水剂
特性： 乙醇具有固定、脱水等多种功能。组织在高
浓度乙醇中放置时间过长时，易发脆。
50%以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪、类脂体、
色素等，注意制片的目的。
4%多聚甲醛液
Bouin氏液
•配制方法：饱和苦味酸溶液75ml
40%甲醛25ml
冰乙酸5ml
•固定时间：12—24h
•固定后处理：70%乙醇脱去苦味酸产生的黄色 •适用组织：常备固定液，特别适用于固定皮肤 和胚胎组织。
五、固定后处理
除去组织中渗入的固定液和一些由固定液产生的沉淀、 结晶和色素的步骤称为固定后处理。
取
一、动物的处死
手法迅速、快捷。 常用方法：
材
1. 麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（乌拉坦或者 戊巴比妥）。 2. 空气栓塞法：耳静脉，20－30ml空气 3. 击头法：重物猛击，迅速致死。 4. 颈椎脱臼法：小白鼠 5. 破坏脑和脊髓：金属探针，蛙 6. 股动脉放血：麻醉后放血使大动物迅速死亡。
织学也建立起一整套完整科学的组织制片技术。
组织制片技术的发展史
特别是20世纪50年代以来，由于组织化学、 免疫组织化学等新技术和新仪器的出现，使组织制 片技术的应用领域进入了一个崭新的时期。
组织制片的意义和目的
利用组织制片技术的方法所制出的标本， 显示了组织细胞的结构和形态、组织细胞之间的 相互连接及组织细胞中的某些化学成分的种类和
调节恒温水箱水温至47℃左右；
固定蜡块于固定器；
快修装置修整包埋面；
调节切片厚度至4—6微米；
连续切片；
摊片于水箱内；
将蜡片贴于涂好粘片剂的载玻片上；
置于温箱内烤片。
三、切片的注意事项
① 切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧，否则会
引起切片机各部件震动，造成切片厚薄不匀。
② 包埋块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应 按切片机刀台上的刻度作适当调整。 ③ 恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低 5℃--6℃。
包
包括浸蜡和包埋两步
一、浸蜡
埋
用石蜡做为支撑剂将组织包埋成块使其硬化的过程
组织透明后，用石蜡置换组织内部的透明剂的
过程称为浸蜡。 组织块浸蜡一般先经过低熔点蜡，再经过高熔 点蜡。
低溶点蜡也称软蜡溶点在48℃--50℃
软蜡箱的温度控制在52℃—54℃之间
组织浸蜡时间一般可达2—4小时 高溶点蜡也称硬蜡溶点在60℃--62℃ 硬蜡箱的温度控制在62℃--64℃之间 组织浸蜡时间一般不超过1小时
二、包埋
组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。
用于包埋的是硬蜡。包埋在包埋器中完成。
修整蜡块时，组织块应距蜡块边缘2—3毫
米，以利于连续切片。
切
石蜡切片
片
组织切片中应用最为广泛的一种切片就是用 石蜡作为包埋剂制作的切片。易于制作大量菲薄 的组织标本，而且包埋块可长期保存。
一、仪器及器材
二、切片过程：
甲醛(Formeldedhyde)
•固定浓度：
•固定时间： •固定后处理：
4%甲醛溶液
12小时—24小时 流水冲洗12小时—24小时
•配制方法： 甲醛10ml + 生理盐水/蒸溜水90ml
特性： 甲醛放置时间过长易产生白色沉淀“三聚甲
醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸性，严重时
可影响到细胞着色。
乙醇(Ethyl alcohol)
组织制片技术的概述
组织制片技术的方法
组织制片技术的基本程序 苏木精—伊红染色
组织制片技术的发展史
从16世纪60年代Hook发明显微镜，开始观察 和描述软木塞中的细胞至今，组织制片技术随着生 命科学的发展而不断进步。
组织制片技术的发展史
在19世纪中期，随着生物、物理和化学等学科
的飞速发展，以及显微镜和切片机的逐步完善，组
• 压片
先将组织处理成小块物质，然后用化学
药品进行软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片
上。例如运动终板和寄生虫标本等。
• 铺片：将需要观察的薄片组织用手工的方法直接
铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成。
例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。
磨片：对于骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，
直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，
主要有以下六种方法： 1. 流水冲洗 ：重铬酸钾、甲醛固定的组织，要经过流水 冲洗24h。
2. 酒精脱黄 : 含有苦味酸的固定液固定的组织，必须经 过70％乙醇洗涤脱去黄色。
3. 4.
碘酒脱汞 ：氯化汞固定的组织有汞结晶，碘酒浸 泡除去。 脱甲醛色素 ：甲醛长期固定的组织易产生黑色结 晶， 70％乙醇－浓氨水溶液除去。
• 配制方法： 多聚甲醛 4g 0.1M PBS溶液 固定时间： 固定温度 24小时 4℃ 100ml
•固定后处理： 流水冲洗24小时 •适用组织： 常用固定剂，适用广泛
乙醇—甲醛液（A—F液）
• 配制方法： 95%乙醇90ml
40%甲醛10ml
• 固定时间：组织块固定4—12小时，
铺片固定 5—10分钟。 • 固定后处理：直接入脱水剂。 • 适用组织：肥大细胞，糖原的固定 。
丙酮
•脱水强，但对组织的收缩脆化作用也强； •主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水，以保护 某些特殊染色的标本不被褪色。
透
一、透明
明
对组织的最后脱水处理。
在经过前一阶段的“脱水”后，还要借某种
有机溶媒将酒精完全置换，使组织与所用的包埋
介质相溶而浸渗。
二、常用透明剂
二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷 、冬青油
2. 蒸汽固定：1－2％锇酸或者甲醛挥发的蒸 汽，多用于涂片固定。
3.灌注固定：（必须进行后固定）
局部灌注固定：肺、肾脏、眼球、肝脏
全身灌注固定：神经系统
三、固定的注意事项：
1. 固定剂的用量 一般为组织块体积的15倍左右 2. 固定剂的配制 现配现用 3. 预固定 4. 固定的时间 一般过夜或者 24小时可达到固