6.冻融法转化农杆菌感受态
农杆菌感受态制备转化
农杆菌感受态制备
1、划平板，单克隆培养
2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day）
3、50m离心管中4500rpm，15min
4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作
5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存
农杆菌转化
1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min
2．37℃热激5min
3. 加1mlLB，28℃培养3-4h
3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干
农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。
（GV3101）
庆大霉素40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平50mg/ml DMSO溶解
200ml LB + 200ul母液
农杆菌转植物
1.植物去顶三天后转化，转前一天交足水
2.摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）
3.室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中（200ml/转化）
每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200ul silwet l-7，混匀，将菌液悬浮，OD=0.8左右。
不得低于0.7.
4.将菌液倒入大平皿中，植株浸泡20s盖上白盆，过夜后揭开正常培养。
农杆菌的培养与感受态制备
农杆菌的培养与感受态制备农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1.取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。
2.取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。
3.菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
4.弃上清，用10ml0.15mol/lNacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
5.弃上清，用2ml20mmol/lCacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。
重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。
2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800μlYEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。
3.28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。
4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。
5.转化烟草等实验材料。
YEB培养基：1.0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。
农杆菌感受态细胞的制备和转化
Pei YX 实验室文档zengjieqiao 第七篇
农杆菌感受态细胞的制备
取-80℃保存的LBA4404于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
挑取单菌落接种于5ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 h。
取2ml菌液转接于100ml YEB液体培养基中，28℃ 220rpm振荡培养至
=0.5。
OD
600
转入无菌离心管，4℃，5000rpm离心5min,去上清液。
溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
加入30ml预冷的(0.05-0.1)M的CaCl
2
4℃ 5000rpm离心5min，去上清。
溶液，轻轻悬浮。
加入4ml预冷的含15%甘油的(0.05-0.1)M的CaCl
2
农杆菌悬浮液分装于无菌1.5 ml Eppendorf管中，每管200μl冻存于-80℃。
注意：(0.05-0.1)M的CaCl
溶液都可以，差别不是很大!
2
转化
分别向200μL根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中分别加入20 ng质粒DNA,轻轻混匀。
在冰浴中共放置30min。
置液氮中速冻5 min。
37℃热激5 min之后。
置冰上5 min,然后加入600μl YEB液体培养基。
于28℃、200 r/min培养4 h。
取100μL菌液均匀涂布于筛选培养基上,28℃放置36-48 h后可见抗性菌落长出。
阳性鉴定
挑去菌落过夜培养，进行菌液PCR！（注意做对照即：空的LBA4404也摇上，同时PCR）。
农杆菌的转化流程
农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26—28℃培养48 h;②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min，离心8 min;④弃上清，加入用100 mM NaCl （4℃预冷）重悬收集的农杆菌；⑤ 4℃，8000 r/min，离心8 min;⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l)的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。
2。
农杆菌的转化(冻融法)将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2—4 h;(或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干，28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中,28℃,250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染.以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行.3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养:① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后,用无菌水清洗两次,更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4)、1。
农杆菌
1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml（含有抗生素） YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4.（将菌液冰浴30min后）转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
农杆菌感受态细胞的制备(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。
(2)取lml活化的菌液接种于50ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。
(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。
(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。
(5)弃上清，用lml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入0.5ml，80%的甘油，混匀。
(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。
冻融法转化土壤农杆菌(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。
(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。
(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻 后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化 当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。 分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要 摇匀。注意比色杯的正确选择及使用 光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均 玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫 匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。 外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以 其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同 上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光 一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。 谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 实验材料： 农杆菌GV3101菌株，重组双 元表达载体pCAMBIA1300 • 试剂： YEB液体培养基（液体和固体）， Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油 。
实验原理：
• 1. 农杆菌简介： 第一例转基因植物就是用 农杆菌介导法完成的。 • 菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属 革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在 某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
NPTII基因以及Lac Z基因等。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒 上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
双元表达载体
双元表达载体中Ti质感受态细胞的制备流程
⑴ 挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB（无 抗）液体培养基中，28℃ 200r/mim振荡培养过夜； ⑵ 按1：100的比例接种于50 ml YEB（利福平Rif 125 mg/L）的培养基中扩培，28℃继续培养至OD600=0.40.6。将菌液置于冰上30min； ⑶ 取1.4ml菌液，5,000 rpm，4℃离心5min，弃上清， 将菌体悬浮于1.0 ml（预冷） 0.15 mol/L NaCl中。 ⑷ 5,000 rpm, 4℃离心5min，弃上清； ⑸ 菌体用120µl 预冷的20mmol/L CaCl2（4℃）轻轻悬浮 细胞，之后加80µl 50%无菌甘油，无菌甘油的终浓度为 20%，液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用或直接用于 转化。
实验五农杆菌感受态细胞的制备与转化实验五农杆菌感受态细胞的制备与转化实验五农杆菌感受态细胞的制备与转化实验五农杆菌感受态细胞的制备与转化实验目的
实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原 理。 •实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体 结构及应用。 技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转 基因鉴定基因功能 ，包括过表达（诱导 型或组成型），RNAi等。
农杆菌感受态制备与转化
双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.
2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min(液氮一分钟)。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2
0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。
玉蜀黍尾孢菌VelB 基因敲除及生物信息学分析
2022，42（2）:056J.SHANXI AGRIC,UNIV .（Natural Science Edition ）学报（自然科学版）04097玉蜀黍尾孢菌VelB 基因敲除及生物信息学分析路媛媛1，孙承龙2，谭玉琴1，魏文杰1，史咸春1，宋艳波1，李丽1，刘振宇3*（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；3.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801）摘要：［目的］通过对玉蜀黍尾孢菌VelB 基因进行生物信息学分析并构建敲除载体，为研究CzVelB 调控玉蜀黍尾孢菌致病性的分子机制奠定基础。
［方法］从JGI 数据库中获得CzVelB 基因序列，对其进行生物信息学分析，包括蛋白质的性质、保守区域、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构域和聚类分析，分析其基因功能。
并采用同源互补原理构建CzVelB 基因敲除载体，最终采用农杆菌介导遗传转化技术进行基因敲除。
［结果］CzVelB 基因编码385AA ，预测pI 和MW 分别为9.05和42.13645kDa ，是亲水性蛋白，无跨膜结构域。
在亚细胞水平上，CzVelB 定位在细胞核中。
在氨基酸序列方面，具有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点；在功能上具有2个Velevt 的保守结构域，并与As⁃pergillus flavus 、A.niger 亲缘关系较近，具有较高同源性。
根据CzVelB 基因序列设计特异性引物，扩增侧翼片段和标记基因，分别连入骨架载体pPZP100中，成功构建CzVelB 基因的敲除载体，最终利用ATMT 技术获得其敲除转化子。
［结论］本文系统研究玉蜀黍尾孢菌VelB 基因功能，并成功构建其敲除载体，获得敲除转化子，为后续研究CzVelB 基因功能提供基础材料。
关键词：玉蜀黍尾孢菌；VelB ；生物信息学；敲除载体；敲除突变体中图分类号：S432.1文献标识码：A文章编号：1671-8151（2022）02-0056-09玉米灰斑病是世界玉米种植区重要真菌性病害之一，其病原菌为玉蜀黍尾孢菌（Cecrospora ze⁃ae⁃maydis Tehon &Daniels ），属子囊菌门球腔菌属真菌［1］。
棉花VIGS流程
VIGS1）TRV2:: bHLH 瞬时表达载体的构建根据ORF2测序结果，设计特异引物，以TM-1叶片的cDNA 为模板进行PCR 扩增到的片段与克隆载体PMD19-T Vector 连接，筛选获得阳性克隆后，进行DNA 测序。
测序成功的与TRV2相连，菌落PCR 鉴定。
提取阳性克隆的质粒，酶切鉴定后保留，准备转化农杆菌菌株GV3101。
酶切反应体系如下表所示：质粒DNA 10.0µL10 XBuffer 2.0µL核酸内切酶 1.0µLddH2O 7.0µL总体积20.0µL2）根癌农杆菌GV3101 感受态细胞的制备农杆菌感受态细胞的制备方法如下所示：（1）挑取单菌落GV3101，接种于5mL 附加有50mg/L 的利福平的LB 液体培养基中，28˚C，200rpm 过夜培养。
（2）取2mL 培养物至液体LB 50mL 中，继续培养至OD600为0.5～1 左右。
（3）将培养物冰浴30min，4˚C，5000rpm，离心5min。
（4）弃去上清，10mL 冰预冷的0.1M NaCl （高压灭菌）悬浮菌体；4˚C，5000rpm，离心5 min。
（5）弃去上清，用1mL 冰预冷的20mM CaCl2（高压灭菌）悬浮沉淀，分装成200µL/管，液氮中冷冻后-70˚C 保存。
3）冻融法转化农杆菌（1）冰浴融化感受态细胞，加入10～15µL 质粒DNA，冰浴20min，液氮中冷冻1min，37˚C 温浴3～5min。
（2）加入1mL 无抗生素的新鲜LB，28˚C，200rpm，3～5h。
（3）12000rpm 离心1min 以浓缩菌液，将离心后的菌液混匀涂于附加50mg/L 卡那霉素，50mg/L 利福平的固体LB培养基上，置于28˚C 下培养2～3d。
挑取克隆进行菌落PCR 验证。
4）烟草叶片注射（需要摇的菌①TRV2②TRV1③CLA)（1）将转化入质粒TRV1 和TRV2 的农杆菌GV3101 接种于5mL LB 液体培养基，培养基中还有卡那霉素（50mg/L）、利福平（25mg/L）。
冻融法转化农杆菌
冻融法转化农杆菌一、实验原理转化是指宿主细胞直接吸收外源DNA分子（如质粒载体或重组体等等），并获得某些新遗传性状的过程。
1970年Mandel 和Higa首次报道了用CaCl2处理大肠杆菌，使其吸收来自于λ噬菌体的DNA。
1972年，Cohen等指出CaCl2处理大肠杆菌对质粒DNA的吸收也是有效的。
我们将细胞能够吸收外源DNA的状态称为感受态。
通过CaCl2处理以及温度的变化等可使细胞壁和细胞膜的结构发生改变，从而更利于吸收外源DNA。
外源DNA进入细胞后，或整合到染色体上，或游离于细胞质中。
通过外源DNA上的基因在受体细胞中的表达，使细胞产生不同于野生型细胞的新的性状，进一步可在选择性培养基上筛选转化体。
二、实验仪器设备摇床、离心机、PCR扩增仪、恒温箱、水浴锅、-70℃冰箱、无菌三角瓶、移液器、无菌平皿、冰盒、1.5 mL 离心管、无菌枪头、接种环、涂棒三、材料消耗费本实验需材料消耗费50元/组，具体消耗品如下：液体LB或YEB培养基、抗生素（Rif、Km、Sm）、无菌水、液氮、质粒DNA、农杆菌LBA4404、0.1mol/L CaCl2四、实验内容步骤1、感受态制备（1）挑取农杆菌单菌落接种于5mL液体YEB培养基中，28℃，200~250rpm振荡培养至OD600为0.5左右。
按1:10的比例转接到新鲜的液体YEB培养基中，28℃，200~250rpm 振荡培养至OD600为0.5左右。
冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用10mL 0.02mol/L CaCl2重悬菌体。
（2）再次离心（同上），菌体悬浮于1mL 0.02mol/L CaCl2溶液中。
（3）取50μL 菌液分装到1.5mL 离心管中，用液氮迅速冷冻，并保存于-80℃冰箱中。
2、转化（1）取0.5 ~1.0μL的质粒DNA，加入到50μL冰上解冻的菌液中，轻轻混合，冰浴5分钟，并在液氮中迅速冷冻5分钟，37℃水浴5分钟。
农杆菌直接转化法：冻融法
Ⅲ、农杆菌直接转化法：冻融法一旦预期的分子在大肠杆菌中被构建，该分子可通过冻融法直接转化入土壤农杆菌中。
尽管与三亲杂交法相比，冻融法转化的效率仅为103个转化子/mgDNA，但该法是可靠快速的。
该法也可以去除三亲杂交法造成的质粒重排现象。
1、含有辅助Ti质粒的农杆菌单菌落（2-3mm）接种于5mlYEP培养基中，28℃过夜培养；2、取1ml过夜培养物于含有100mlYEP的250ml三角瓶中，并在28℃下，剧烈振荡（250rpm）培养至OD值为0.5-0.6；3、取50ml培养物置于冰上冷却5min，4℃，5000rpm，离心5min；4、A、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），用于后续试验；B、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），并添加15%的甘油，液氮速冻后，-80℃保存；5、A、直接取分装后的感受态农杆菌（0.1ml/管），加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；B、取-80℃保存含感受态菌株的Eppendorf小试管一支，在冰上融解后，加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；6、冰上放置30min，再用液氮速冻5min；7、将小管放于37℃水浴中5min，融解细胞；8、加入1mlYEP培养基于试管内，28℃，200rpm，振荡培养2-4h。
该过程使得菌体表达抗生素抗性基因；9、4℃，5000rpm，离心30s，弃去上清液，再用0.1mlYEP培养基重悬沉淀细胞；10、涂布重悬物于含有20μg/mlRif和50μg/mlKanamycin的YEP平板上，28℃共育。
2-3d后转化克隆出现。