第十二章 细胞增殖及其调控

第一节 细胞周期与细胞分裂
一、细胞周期
（一）细胞周期概述
细胞周期指连续分裂的细胞从一次分裂结束到下一次分裂的结束所经历的过程。正常情况下，沿着 G1 、S 、 G2 、 M期运转。
细胞周期经历的时间称为细胞周期时间（Tc）。 tG1变化最大，而tG2+tS+tM则相对稳定。
从增殖的角度看，细胞可分为3类：
①连续分裂细胞（周期中细胞）；
在细胞周期连续运转。
②静止期细胞（G0期细胞）；
暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但在适当刺激下可重新进入细胞周期的细胞。周期中细胞转化为G0期细胞多发生在G1期。
③终端分化细胞。
分化程度很高，一旦生成后，则终生不再分裂。

（二）细胞周期中各个不同时期及主要事件
1、G1期
G1期合成细胞生长所需要的各种蛋白质、糖类、脂类等 ，但不合成DNA。
细胞周期的运转十分有序。这是基因有序表达的结果， 与细胞分裂有关的基因，叫细胞分裂周期基因（cdc基因）。此种基因的有序表达，是受到一些控制点调控和监控的。如酵母细胞在DNA开始的稍前有启始点，在哺乳类叫R点（限制点，检验点）。
检验点不仅存在于G1期，也存在于其他时期，如S期检验点、G2期检验点、纺锤体检验点等。这些特异的监控机制（检验点）可以监别细胞周期中的错误，并诱导产生特异的抑制因子，阻止细胞周期进一步运行。
2、S期
S期即DNA合成期。新的组蛋白也是在S期合成的。真核细胞新合成的DNA立即与组蛋白结合，共同组成核小体串珠结构。
3、G2期
细胞核内DNA的含量已经增加一倍。其它结构物质和相关的亚细胞结构也已进行了进入M期的准备。但细胞能否顺利地进入M 期，要受到G2期检验点的控制。
4、 M 期
M期即细胞分裂期。
真核细胞的细胞分裂产要包括两种方式，即有丝分裂和减数分裂（成熟分裂）。

细胞周期中有那些主要检验点？各起什么作用？
1）G1/S期检验点：在酵母中称为start点，在哺乳动物中称为R点（restriction point），检验DNA是否损伤，细胞外环境是否适宜，细胞体积是否足够大。
2）S期期检验点：检验DNA复制是否完成。
3）G2/M期检验点：检验DNA是否损伤，细胞体积是否足够大。
4）中-后期检验点：纺锤体组装检验点。

（三）细胞周期长短测定
1）脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法：适用于细胞种类构成相对简单，细胞周期时间相对较短，周期运转均匀的细胞群体。其原理是用3H-TdR对测定细胞进行脉冲标记，定时取材并利用放射自显影技术显示标记细胞，统计标记的有丝分裂细胞的比例，以标记后的时间为横坐标，以

标记的有丝分裂细胞的比例为纵坐标，通过读图测定细胞周期，一般采用半高度的读法；

2）流式细胞仪测定法：处于不同分裂时期，细胞内DNA含量不同，利用流式细胞仪可以测定单个细胞内的DNA的含量。期过程为：应用某些药物对细胞进行处理，将细胞抑制在细胞周期的某个特定时期，然后将细胞从抑制中释放出来，所有细胞将会同步运转，以释放后的时间为横坐标，单个细胞内的DNA含量为纵坐标作图，通过读图得到各分裂期的时间。

3）其他方法：通过显微缩时摄像技术可以求出分裂间期和分裂期的准确时间；通过在不同的时间对细胞群体进行计数，可以推算出细胞群体的倍增时间，即细胞周期的总时间。
1、脉冲标记DNA复制的细胞分裂指数观察测定法
2、流式细胞分选仪测定法

（四）细胞周期同步法
细胞周期同步化是利用人工诱导或药物诱导的方法，使细胞同步化在细胞周期的某个特定时期，从而获得处于相同细胞周期的细胞作为实验材料。常用的方法有：人工选择同步化和药物诱导同步化。还可分为自然同步化和人工同步化。

自然同步化的例子有：
1）海胆受精卵最初几次分裂是同步的；
2）细菌的休眠孢子进入营养环境后能发生同步萌发；
3）黏菌变形体进行多次核分裂后，再进行同步细胞分裂。

人工同步化包括：人工选择法和人工诱导法（药物诱导法）
1）人工选择法：有丝分裂收集法和密度梯度离心法。
a.有丝分裂选择法：这种方法主要用于单层贴壁生长细胞，M期时该细胞变圆，与培养板之间的附着力下降，将培养瓶轻轻振荡，M期的细胞就会脱落下来。
b.密度梯度离心法：根据不同时期的细胞在体积和重量上的差异进行分离。

2）人工诱导法：DNA合成阻断法和分裂中期阻断法。
a.DNA合成阻断法：采用低毒或无毒的DNA合成抑制剂——脱氧胸苷，以一定浓度处理培养的细胞群体，经过一段时间后，几乎所有的细胞被抑制在S期或G1/S期，在换成无抑制剂的新鲜培养液处理一段时间，在用一定浓度的抑制剂处理一定时间，可以将细胞抑制在G1/S期交界处狭窄的时间区段。
b.分裂中期阻断法：用秋水仙素通过抑制纺锤体的组装从而将细胞周期抑制在有丝分裂中期。

优缺点：1. 自然同步化难以获得大量的同步化细胞。

2. 人工选择同步化中的有丝分裂收集法，每次获得的细胞数量有限，需要多次收集，成本高，但是没有经过任何药物处理，能够反映细胞周期的真实情况，且同步化效率较高；而密度梯度离心法对大多数种类的细胞并不适用，但是其成本低，效率高，操作简单。

3. 人工诱

导法可在短时间内获得较多的同步化细胞，成本低，但是应用的化学药物会对细胞的正常生理产生影响，如果药物浓度过高，会导致一些细胞无法回到细胞周期中，甚至死亡。

二、有丝分裂
（一）有丝分裂过程
1、前期
染色质浓集成早期染色体， 在光镜下早期染色体的两条染色单体已经可以分辨。在每条染色体上，都有一段特殊的DNA序列，称为着丝粒DNA。其所在部位称为着丝粒（主缢痕）。
中心体与其周围的微管一起被称为星体（在动物细胞中） 。中心体在间期也进行了复制。细胞分裂开始，两个星体即逐渐向细胞的两极运动。
2、前中期
① 核膜破裂，标志着前中期的开始。
② 纺锤体的装配。
3、中期
所有染色体排列到赤道板上，纺锤体呈典型的纺锤样。
4、后期
后期开始，几乎所有的姊妹染色单体同时分裂，此时每条染色单体为子代染色体。
5、末期
染色体平均地分到两极，即进入末期。核膜开始重新装配。染色体去螺旋化，分散在间期核中，核仁重新出现。
6、胞质分裂
开始于细胞分裂后期，完成于细胞分裂末期。
①动物细胞 ：
胞质分裂 开始时，在赤道板周围细胞表面下陷形成环状缢缩，称为分裂沟。分裂沟逐渐加深，直至两个了代细胞完全分开。
肌动蛋白和肌球蛋白参与了分裂沟的形成和整个胞质分裂过程。在分裂沟的下方，除肌动蛋白之外，还有微管、小膜泡等物质聚集，共同形成一个环状致密层，称为中间体。胞质分裂机制，和肌肉收缩机制相似。
②植物细胞：
植物细胞有细胞壁，其胞质分裂，新壁的形成与动物细胞不同。

（二）与有丝分裂直接相关的亚细胞结构
1、中心体
中心粒是一对互相垂直的圆筒状小体，筒壁为9组三联微管组成。
中心体由一对中心粒及其周围的无定型物质构成。
中心体在S期复制。G2期开始分离， G2晚期到M期，子中心粒不断长大，逐渐分离到两极的两对中心粒具微管组织中心的作用，组织形成纺锤体及星体。

2、动粒与着丝粒
动粒（着丝点）是附着于着丝粒上的一种细胞器。在S期复制，电镜下为一个圆盘状结构，分内、中、外三层。主要由蛋白质组成，并有少量的RNA和DNA，是有丝分裂时纺锤体微管附着于染色体的部位。
着丝粒是指染色体主缢痕部位的染色质。由卫星DNA构成。

3、纺锤体
纺锤体是细胞分裂过程中的一种与染色体分离直接相关的细胞器。组成纺锤体的微管可以分为两种类型，即动粒微管和极性微管。

（三）有丝分裂过程中染色体运动的动力机制

1. 细胞通过什么机制将染色体排列在赤道板上？有何生物

学意义？
答：首要的两组蛋白质是Mad蛋白和Bud蛋白，二者位于前期和前中期染色体的动粒上，可以使动粒敏化，促使微管与动粒接触，只有等到染色体被微管捕捉并排列到赤道板上，Mad2和Bud1从动粒上消失，后期才能开始启动。

目前流行两种学说，一是牵拉（pull）假说：染色体向赤道板方向移动，是由于动粒微管牵拉的结果，粒微管越长拉力越大，当来自两极的动粒微管拉力相等时，染色体即被稳定在赤道板上；二是外推（push）假说：染色体向赤道板方向移动是由于星体的排斥力将染色体外推的结果，染色体距离中心体越近，星体对染色体的推力越强，当来自两极的推理达到平行时，染色体即被稳定在赤道板上。

生物学意义：1）微管与动粒接触后促使一些蛋白质分子从动粒上释放出来，促使APC活化，使细胞分裂从中期进入到后期；
2) 保证每条染色体的两条染色单体分离后分别移向细胞两极，确保细胞经过有丝分裂后染色体数目保持恒定，保证了生物体的遗传稳定性。

2.说明细胞分裂后期染色的单体分离和向两极移动的运动机制？
答： APC后期促进因子复合体，可启动细胞分裂向后期进行。Cdc20可激活APC，但是有丝分裂前期Cdc20和Mad2蛋白位于染色体的动粒上，由于Mad2与Cdc20结合抑制Cdc20的活性，所以只有染色体与微管结合后，Cdc20释放出来激活APC，才能启动细胞分裂向后期转换。

后期大致可分为连续的两个阶段：后期A和后期B。
1）在后期A，动粒微管变短，染色单体逐渐向两极运动；
2）在后期B，极微管长度增加，来自两极的极微管在赤道区相互重叠，通过马达蛋白介导相互滑动，使两极推开的更远。

三、减数分裂
是一种特殊的有丝分裂方式。生殖细胞在成熟过程中发生减数分裂。其特点是，DNA复制一次，然后发生两次连续的有丝分裂，导致最终生成的细胞的染色体数减半。
（一）减数分裂前间期
最大特点在于S期持续时间较长。
另一个重要特点是，在植物百合中发现，其减数分裂前间期的S期仅复制其DNA总量的99.7%~99.9%，而剩下的（DNA小片段）0.1~0.3%要等到减数分裂前期才进入复制。
另外还发现，在一种L蛋白，在前间期与上述DNA小片段结合，阻止其复制。
（二）减数分裂过程
1、减数分裂期Ⅰ
（1）前期Ⅰ
根据细胞形态的变化，又可将前期Ⅰ人为地划分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期等5个阶段。
①细线期（凝集期）
染色质开始凝集，但乃呈单条细线。
②偶线期（配对期）
主要发生同源染色体配对，此过程称为联会。联会的同源染色体间形成一种特殊结构叫联

会复合体（SC）。联会的一对同源染色体共有4条紧密结合在一起的染色单体，称为四分体。
另一个重要事件是合成在S期未合成的0.3%的DNA。
③ 粗线期（重组期）
染色体明显变粗，同源染色体之间发生DNA片段交换，在SC的梯状结构中出现重组节，通过重组节发 生活跃的重组过程。
④双线期（合成期）
同源染色体分开，但有几点相连，同源染色体之间的接触点称为交叉。每一个四分体上至少有丝分裂个交叉。
⑤终变期（再凝集期）
染色体更加变粗。交叉明显，数量减少。交叉向染色体的端部移行，称为端化。核膜、核仁消失。纺锤体形成。

（2）中期Ⅰ
同源染色体的每一对姊妹染色单体在着丝粒处并连在一起，1对动粒朝向同一极，同源染色体的两个染色体通过动粒微管分别连向不同的极。四分体逐渐向赤道方向移动，最终排列在赤道面上。

（3）后期Ⅰ
同源染色体的 两个染色体分离，分别移向一极。每极的染色体数比亲代细胞减少了一半，为1n。第1染色体为1二分体，仍由2条染色单体组成，因而每极的DNA含量仍是2C（C代表1个基因组或单倍的DNA量）。

（4）末期Ⅰ，胞质分裂和减数分裂间期
细胞进一步的变化主要有两种类型：①染色体到达两极，并逐渐进行去凝集。核被期重新装配，形成两个子细胞核。此时的间期细胞不再进行DNA复制，称为减数分裂间期；②细胞进入末期后，不是完全回复到间期阶段，而是立即准备进行第二次减数分裂。
第一次分裂后，产生2个细胞。有的生物细胞质不分裂。

2、减数分裂Ⅱ
与有丝分裂过程基本相同，可分为前、中、后、末期。通过第二次分裂，每个核的DNA含量又减少一半。
经过第二次减数分裂，共形成4个单倍体细胞。高等动物的雄配子与雌配子的发生有所不同，在雌性动物通过减数分裂形成4个有功能的精子，后者只形成一个有功能的卵子，其余3个细胞变成极体。
减数分裂不仅是使有性生殖的生物种类染色体数目保持稳定的机制，而且是使生物变异的机制。减数分裂中，由于有同源染色体的配对，不同对同源染色体分裂时的自由组合，非姊妹染色单体间DNA片断交换、重组，而形成了庞大数量的不同基因组成的配子，从而增加了变异性。

（三）减数分裂过程的特殊结构及变化
1、性染色体的分离
2、联会复合体的基因重组
联会复合体是同源染色体之间在减数分裂前期联会时所形成的一种临时性结构，由中央成分组和位于两侧的侧成分共同构成。
主要成分是蛋白质，另外DNA、RNA也是联会复合体的组成成分之一。

第二节 细

胞周期的调控
一、MPF的发现及其作用
MPF，即卵细胞促成熟因子，或细胞促分裂因子，或M期促进因子。

二、 p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系
MPF含有两个亚单位，即Cdc2蛋白和周期蛋白。当两者结合后，表现出蛋白激酶活性。 Cdc2为其催化亚单位，周期蛋白为其调节亚单位。
正是由于不同的细胞周期蛋白和不同的基因产物的结合、分离、磷酸化与去磷酸化、激活催化亚单位的激酶活性，而成为驱动细胞周期运转的引擎。

三、周期蛋白
M期周期蛋白，如周期蛋白A、B等。

四、CDK激酶和CDK激酶抑制物
周期蛋白依赖性蛋白激酶，简称CDK激酶。是细胞周期调控中的重要因素。
CDK激酶至少含有两个亚单位，即周期蛋白和CDK蛋白。周期蛋白为其调节亚单位，CDK蛋白为其催化亚单位。
一种酶在细胞周期中起调节作用的时期不同。CDK激酶活性也受其他因素的直接调节。
细胞内存在多种因子，对CDK分子结构进行修饰，参与CDK激酶活性的调节。除周期蛋白和上述修饰性调控因子对CDK激酶活性进行调控之外，细胞内还存在一些对CDK激酶活性起负性调控的蛋白质，称为CDK激酶抑制物（CDKI）。
除CDK激酶及其直接的活性调节因子外，还有不少其他因素参与细胞周期调控过程，如各种检验点等。各种检验点也有专门的调控机制。所有这些因素组成一个综合的调控网络。

综合：举例说明CDK激酶在细胞周期中是如何执行调节功能的？
答：CDK激酶是正调控因子。以MPF为例：MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶，即CDK1激酶，由cdc2p34蛋白和周期蛋白B结合而成。CDK1激酶的活性首先依赖于周期蛋白B的含量的积累，活化的CDK1激酶可使更多的下游蛋白质磷酸化。

活化的CDK1激酶促使分裂期细胞在分裂前期执行下列生化事件：
1）染色质开始浓缩形成有丝分裂染色体；
2）细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体开始组装；
3）高尔基复合体，内质网等细胞器解体，形成小的膜泡。

有丝分裂后期，活化的后期促进因子APC主要介导两类蛋白的降解，后期抑制因子和有丝分裂周期蛋白。前者维系姐妹染色单体黏连，抑制后期启动；后者的降解意味着CDK1激酶失活，有丝分裂将结束。


六、其他内在和外在因素在细胞周期调控中的作用
除上述各种因素参与细胞周期调控之外，还有其它因素参与细胞周期调控。
（一）癌基因与抑癌基因
两者均是细胞生命活动所必须基因，其表达产物对细胞增殖和分化起着重要的调控作用。癌基因非正常表达可导致细胞转化，增殖过程异常，甚至癌变。
抑癌基因表达产物对细胞增

殖起负性调节作用，如p53、Rb等。 p53是近年来研究得较多的人类抑癌蛋白之一。 p53基因突变，使细胞癌变的机会大大增加。
癌基因、抑癌基因和cdc基因共同协作调节细胞周期的正常运转。
（二）外界因素对细胞周期的影响
如离子辐射、化学物质作用、病毒感染、温度变化、PH变化等。
子辐射对细胞最直接的影响之一是DNA损伤。