不同受精方式对单原核胚胎发育潜能的影响

不同受精方式对单原核胚胎发育潜能的影响【第一作者简介】王珊珊(1986-)，女，实习研究员、硕士，主要从事生殖医学研究。

【摘要】目的:探讨常规体外受精（IVF）及卵胞浆内单精子注射（ICSI）后单原核胚胎的发育潜能，为提高卵子利用率探寻可行的方法。

方法:回顾性分析3614个IVF周期和1306个ICSI周期的患者资料。

按照年龄分为35岁3组，分析不同授精方式下女方年龄对单原核受精卵出现的影响，并进一步研究35岁以下患者中，不同授精方式对单原核胚胎发育潜能的影响。

结果:在IVF和ICSI周期中，>35岁组的单原核受精卵形成率显著高于<30岁组(P<0??05)。

35岁以下女性患者中，IVF组单原核胚胎的囊胚形成率及优质囊胚形成率显著高于ICSI组（28??97% vs 12??12%，11??90% vs 0），并具有统计学差异(P<0??05)。

结论:女方年龄、授精方式可能与异常受精的发生有关。

在行辅助生殖技术（ART）时应综合考虑这些因素，为临床提高卵子利用率提供新思路。

【关键词】体外受精；卵胞浆内单精子注射；单原核Influence of different fertilization modes on the developmental potential of monopronucleus embryosWANG Shanshan, ZENG Huiming, ZHANG Ningyuan, SUN Haixiang△. Reproductive Medicine Center, Drum-Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China【Abstract】Objectives: To investigate the developmental potential of monopronucleus embryos in in-vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) to explore a feasible approach for improving the utilization rate of oocytes. Method: Data of 3614 patients in IVF cycles and 1306 patients in ICSI cycles were retrospectively analyzed respectively, and divided into three groups according to age of patients, 35 years group. The impact of age on monopronucleus zygotes was analyzed in different fertilization modes and the influence of different fertilization modes on the developmental potential of monopronucleus zygotes was further studied in group of patients under 35 years old. Results: The formation rate of monopronucleus zygotes for the group >35 years was substantially higher than that in group <30 years (P<0??05) in IVF and ICSI cycles. Among female patients under 35 years old, the blastocyst rate and high-quality blastocyst rate of embryos from monopronucleus zygotes in the IVF group were substantially higher than the ICSI group (28??97% vs 12??12%, 11??90% vs 0), with statistically significant differences(P<0??05). Conclusion: The age of female patients and fertilization modes may be related to the occurrence of abnormal fertilization. Multiple factors should be considered during assisted reproductive technology (ART), to provide new ideas for improving the utilization of oocytes.【Key words】In vitro fertilization; Intracytoplasmic sperm injection; Monopronuclear【中图分类号】R329.1【文献标志码】A在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）过程中，卵子在常规体外受精（in vitro fertilization, IVF）或卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）后16~18h，显微镜下观察到两个原核（2PN），且在卵周隙内可见2个极体，该受精卵则被判断为正常受精，而出现单原核（monopronucleus zygotes,1PN）及多原核（≥3PN）则视为异常受精。

有研究报道，多核胚胎不仅使胚胎的着床失败率和自然流产率升高，还可导致葡萄胎的产生和染色体异常儿的出生，不能用于移植\[1\]。

对于单原核胚胎，是否有可利用价值，目前尚无定论。

因此，临床上通常选择正常受精而发育形成的优质胚胎进行移植。

细胞遗传学研究表明，发生卵裂的单原核卵子80%为二倍体，12%为单倍体，另有7%为三倍体\[2\]。

除了遗传学因素外，不同授精方式在卵裂的过程中也起着非常重要的影响，导致1PN胚胎的染色体组成不同。

Yan J等\[3\]研究显示，常规IVF周期中约54??35%的1PN胚胎为二倍体，而ICSI周期中只有约31??51%的1PN胚胎为二倍体，提示IVF周期中1PN受精卵发育形成的胚胎有一定可利用价值。

本研究通过回顾性分析4920个周期的患者资料，探讨不同年龄及不同授精方式下，单原核胚胎的发育潜能，为进一步提高卵子及胚胎的可利用率提供指导。

1材料与方法1??1研究对象选择2012年1月至2013年8月在南京大学附属鼓楼医院生殖医学中心治疗的3614个IVF周期和1306个ICSI周期的患者资料进行回顾性分析。

排除完全受精失败、部分受精失败及卵子发育异常的患者。

年龄分组以30岁和35岁为界点分为3组。

由于35岁以上女性的卵母细胞质量明显下降，所以仅研究年龄小于35岁患者的1PN胚胎的发育潜能。

其中IVF组1159枚1PN胚胎，ICSI组156枚1PN胚胎。

1??2人卵母细胞的采集与处理按常规方案超促排卵，卵泡生长发育充分后，在B超介导下经阴道穿刺取卵。

获取的卵丘-卵母细胞复合物（OCCs）经Gamete (Vitrolife, Sweden) 洗涤后，转入IVF(Vitrolife, Sweden)序贯培养微滴中，于37℃/6% CO2培养箱行3h的受精前培养。

1??3受精与卵裂观察1??3??1IVF采用短时受精方法，获卵3h后按10000条精子/卵母细胞的比例加精。

精卵共孵育4 h后机械剥离颗粒细胞，转入G1 (Vitrolife, Sweden)序贯培养液中培养。

通过观察第二极体是否形成判断受精，16~18h后将培养皿置于倒置显微镜下观察原核。

1??3??2ICSI孵育3h后的卵母细胞经透明质酸酶(Vitrolife, Sweden)消化后机械剥离颗粒细胞。

将卵子置于IVF 培养液预培养1 h后，挑选形态相对正常的精子对成熟卵母细胞行ICSI术。

注射后的卵母细胞转入G1培养液中培养，16~18h后将培养皿置于倒置显微镜下观察原核，判断是否受精。

若出现单个原核，则为1PN；行IVF或ICSI术后，正常受精卵出现2个原核(2PN)。

受精后分别于44 h及68 h在倒置显微镜下进行胚胎质量评估1??4囊胚培养及观察将Day3剩余的分裂期胚胎转入囊胚培养液G2 (Vitrolife, Sweden)微滴中，继续培养至Day6，观察囊胚发育情况。

根据Garnder囊胚分级法对囊胚进行分级\[4\]。

首先，根据囊胚的扩张及孵出程度将囊胚分成1~6级：1级，早期囊胚,囊胚腔体积囊胚总体积的1/2；3级，完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；4级，扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；5级，正在孵化的囊胚，囊胚正在从透明带破裂口孵出；6级，孵化出的囊胚,囊胚完全从透明带中脱出。

3~6级囊胚需要对滋养外胚层细胞(trophectoderm, TE)和内细胞团(inner cell mass, ICM)进行进一步评估。

TE评分：A级，细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布；B级，细胞数目较少，上皮细胞较松散；C级，细胞数目极少。

ICM 评分：A级，细胞数目多，结合紧密；B级，细胞数目较少，结合较松散；C级，细胞数目极少。

本中心将评分≥3BC的囊胚定为优质囊胚。

1??5统计学分析结果以均数±标准差(±s)或率(%)表示，采用SPSS 17??0软件对数据进行统计分析。

率的比较采用χ2检验，多组间结果比较采用单因素方差分析（One-Way ANOV A），P<0??05为差异有统计学意义。

2结果2??1女方年龄对ICSI胚胎单原核形成的影响在ICSI周期中，女方不同年龄组间1PN形成率呈递增趋势，>35岁女性患者的1PN形成率为2??75%，显著高于<30岁组（1??59%），且有统计学差异（P<0??05）。

见表1。

表1ICSI周期女方年龄对1PN形成的影响年龄（周岁）获卵数1PN形成率（%）3511832.75±0.12*P 35岁组相比2??2女方年龄对IVF胚胎单原核形成的影响IVF短时受精后，女方不同年龄组间1PN形成率呈递增趋势，并且>35岁女性患者的1PN形成率最高，为4??24%，显著高于< 30岁组，两组间有统计学差异（P<0??05）。