代谢组学预测胚胎发育潜能的研究进展

代谢组学预测胚胎发育潜能的研究进展
作者：朱云珊霍鹏左晓旭张顺
来源：《中国医学创新》2016年第35期
【摘要】保证辅助生殖技术治疗成功的一个关键步骤是客观评估胚胎的发育潜力，以确保挑选最具着床潜力的植入前胚胎用于移植。

目前所使用的胚胎评估方法很大程度上基于胚胎的形态，虽然这种方法能保证可观的妊娠率，降低了多胎妊娠率，但是其精确度仍不高。

因此，建立一种客观、准确、快速评估卵母细胞和胚胎发育潜能的评估方法极为重要。

代谢组学作为新兴的技术手段在胚胎评估的应用上有着较大的潜力。

本文主要对胚胎的代谢组学研究进行概述，包括胚胎培养基中葡萄糖、乳酸、丙酮酸、氨基酸、氧耗量等代谢情况，同时也概述了光学光谱和非光学光谱的代谢组学技术分析胚胎培养基谱对于评估胚胎的意义和建立模型的可行性，为当前胚胎评估方法提供可行的补充。

【关键词】胚胎发育；评估；代谢；培养液
Research Progress on Metabonomics in the Analysis of Embryo Development Potential/ZHU Yun-shan，HUO Peng，ZUO Xiao-xu，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：135-138
【Abstract】 A key step in assisted reproduction is the assessment of embryo developmental potential in order to determine the embryo most likely to result in pregnancy.Currently used embryo assessment strategies are largely based on embryo morphology.Although these systems have been successful in improving pregnancy rates and reducing multiple gestations，their precision is still insufficient.Therefore，development of an objective，accurate，fast and affordable test that can aid in the assessment of embryo developmental potential is a significant aim of reproductive medicine.Metabonomics as a novel technology has great potential in the application of embryo assessment，this article mainly summarized the research of metabolomics on embryo，and these include the measurement of glucose，lactate，pyruvate or amino acid levels in the embryo culture media，assessment of oxygen consumption by the embryo.Recent studies suggest that metabolomic profiling of embryo culture media using optical and non-optical spectroscopies may provide a useful adjunct to the current embryo assessment strategies and provide insight into the phenotype of embryos with increasing reproductive potential.
【Key words】 Embryonic development； Assessment； Metabolism； Culture medium
First-author’s address：Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.033
近年来不孕症的高发病率，使得通过辅助生殖技术——体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）获得子代成为很多不孕家庭的选择。

过去十年美国使用IVF-ET技术治疗不孕症增加了40%，在欧洲经过IVF-ET出生的婴儿总数占所有出生婴儿的比例高达3%。

而在中国，2015年国家卫计委统计数据表明经批准开展人类辅助生殖技术和设置人类精子库的432所医疗机构共完成了70万例治疗，但是海量治疗背后的安全问题更是不容小觑，其中为了保证可观的妊娠率，各辅助生殖从业单位在政策制定的允许范围内增加移植胚胎的数目，使得多胎妊娠率高达30%以上[1-2]。

而多胎妊娠的母婴并发症发生率较单胎妊娠高出数倍，如妊娠期高血压疾病、胎儿宫内发育迟缓、低体重儿、流产、早产及胎膜早破、胎先露、胎位异常、胎儿畸形、双胎输血综合征、胎盘早剥、羊水过多、羊水栓塞、宫缩乏力、产后大出血及贫血等并发症随胎儿数增加而增多，妊娠期亦短。

此外，有研究显示相对于单胎，双胎严重残疾的危险升高了2倍，三胎则升高了3倍[3]。

限制胚胎移植数量的管理法规在许多国家开始生效[4-5]，国内也有一些生殖医学中心在逐步的开展单胚胎移植，该项技术的核心要求就是如何挑选出一个最具发育潜力的胚胎用于移植，传统的胚胎评级——基于形态学特征的评估[6]，而在临床应用中，形态评估法存在诸多缺陷，如评估指标精度不够、受评估者主观经验影响较大、与胚胎质量不是绝对关联等，因此需要一种更为可靠的、能反应胚胎真实着床能力的评估方法，为实施单胚胎移植，有效降低多胎妊娠率奠定胚胎评估与挑选的基础[7]。

近年来诸多研究者将焦点聚集在胚胎代谢液方面，并取得不错的结论。

代谢主要研究的是一系列小分子化合物，包括激素、信号转导分子和生化样品中的次代谢产物，它们为探索基因表达与环境之间的关系提供了很有价值的资料，已成为生物医学的有力工具。

尤其是在辅助生殖技术中，使用培养基中得到的代谢数据，预测胚胎发育潜力，有着较为广阔的应用前景[8]。

胚胎培养液作为胚胎生长发育的环境，能够为胚胎提供水、离子、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子激素、缓冲系统，商品化的胚胎培养液各成分均为已知，在胚胎培养过程中，理论上在胚胎发育的关键节点选取目标代谢物的变化能够反应胚胎的代谢能力、发育潜能以及着床能力，故培养液的成分能够作为胚胎质量的生物标记。

1 胚胎发育代谢组学
1.1 能量代谢能量的产生与利用是细胞生存与发展的基础，糖是胚胎培养液中主要的能源物质，在胚胎发育的过程中糖主要以糖酵解途径（GP）、己糖胺生物合成途径（HBP）和磷酸戊糖途径（PPP）等代谢途径发挥作用。

因此，通过检测胚胎培养液中糖的吸收量和糖代谢源可以作为预测胚胎发育潜能的重要标记。

早在上世纪九十年代，通过代谢分析发现胚胎的能量提供由羧酸向葡萄糖转变是胚胎继续向下一步发育的关键步骤，而这一转折发生在胚胎致密化阶段[9]，在绵羊、猪、牛、大鼠和小鼠等哺乳动物的胚胎阶段的能量代谢研究表明，在桑葚胚形成之前，胚胎发育所需要的能量主要由丙酮酸和乳酸提供，而随后的发育过程，葡萄糖的消耗量逐步增加，而羧酸的代谢大幅下降[10]。

不同的代谢要求和代谢特征由胚胎在发育过程中所处的位置决定，正常受精后的胚胎经由输卵管运输到子宫后植入，而输卵管和子宫的生理环境有着巨大的差别，因此不同阶段的能量代谢特征能反应胚胎的发育潜能[11]。

在IVF-ET
胚胎培养过程中，卵裂期胚胎（D3）培养液中乳酸和丙酮酸的代谢能够很大程度上决定胚胎后续的发育命运，首先研究者发现2-8细胞期的卵裂期胚胎的乳酸和丙酮酸的消耗量与囊胚的形成有关，而随后的研究进一步表明，上述数据与妊娠也有密切的关系。

相对应的，桑葚胚到囊胚的发育阶段，葡萄糖的消耗量能够反应胚胎的发育潜力和活力。

1.2 氨基酸代谢氨基酸在胚胎发育的过程中起着重要作用，它不仅可以为胚胎的生长发育提供营养物质，维持渗透压，还可以拮抗活性氧和清除胚胎新陈代谢生成的氨。

Nadal-Desbarats等[12]应用质子磁共振技术检测胚胎培养液时发现，发育潜能差的胚胎培养液中缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和一些有机酸等被消耗，而发育潜能好的胚胎的培养液中上述各种氨基酸则未被消耗；赵庆红等[13]研究人员也采用上述技术检测培养液中的氨基酸，发现谷氨酸水平与临床妊娠有关。

因此理论上通过研究胚胎培养液中氨基酸的含量可反映胚胎的发育着床潜能。

刘卫卫等[14]利用高效液相色谱（HPLC）技术检测胚胎培养液中氨基酸的浓度时，发现甘氨酸、亮氨酸和天门冬氨酸与妊娠率相关，并指出培养液中天门冬氨酸水平与妊娠率呈正比关系，而甘氨酸和亮氨酸水平与妊娠率呈反比关系。

随后，林楠等[15]使用相同的方法检测冷冻复苏后的胚胎培养液中的氨基酸，发现其培养液中各种氨基酸水平与先前研究的新鲜胚胎一致。

综上所述，通过代谢组学检测胚胎培养液中氨基酸的水平，来准确预测胚胎的发育潜能，在不远的未来也许是一个临床上可行的方法。

1.3 耗氧量随着现代研究的不断深入，更多证据显示，培养环境中的氧含量高低可以影响胚胎的生长发育。

当氧含量高时，细胞内会形成活性氧基团（ROS），其会破坏细胞的DNA、脂肪和蛋白质等，进而造成胚胎的生长发育受损[16]。

然而，胚胎自身还存在一种抵抗活性氧基团的能力，即总抗氧化能力（TAC）[17]。

文献[18-19]报道，TAC降低和ROS升高均可能导致IVF-ET的妊娠率降低。

目前，Lim等[20]将人胚胎干细胞长期培养时发现，低氧有助于促进细胞更新并可以增加染色体的稳定性。

同时，发现低氧环境下培养出的优质胚胎数目和可用胚胎数目增加，并且累积临床妊娠率也明显提高[21]。

随后，Duleba等[22]通过对多囊卵巢综合征（pcos）的患者进行回顾性研究时发现，PCOS不孕症患者与非PCOS不孕症患者相比，其氧化应激反应明显增加，并且氧化应激高反应直接导致IVF-ET不良的妊娠结局。

同时在动物胚胎上研究发现牛的卵母细胞体外成熟率与氧分压的高低无关，但囊胚形成率在低氧的环境下最高，因此认为低氧环境可促进胚胎的发育，但对于胚胎的质量无影响[23-24]。

大量的实验数据已经证明低氧环境能够促进胚胎的发育，但低氧环境是否能够提高临床妊娠率还需要更多的实验资料证实[25]。

1.4 可溶性人类白细胞抗原-G（soluble human leukocyte antigen-G，sHLA-G）人类白细胞抗原-G（HLA-G）是Ⅰ类组织相容性抗原（MHC）的编码产物，在母胎界面绒毛外细胞滋养细胞（extravillous cytotrophoblast，EVCT）上呈现特异性的高表达状态[26]。

HLA-G 抗原有 7 种异构体，HLA-G1蛋白可以在培养基中被检测出，并且它与可溶性异构体很相似，故可溶性的HLA-G的异构体被统称为可溶性人类白细胞抗原（sHLA-G）[27]。

Verloes等[28]通过免疫荧光技术检测胚胎各个阶段sHLA-G的表达情况，发现卵母细胞、卵裂球和囊胚中各个阶段均有sHLA-G的表达。

Rembmann等[29]在多个生殖中心随机收集了两千多个周期的4212份培养液，以评价sHLA-G与临床预后的相关性。

结果证明，sHLA-G是分裂期胚胎的鉴定因子。

随
后又有报道指出，sHLA-G与胚胎的种植潜能成正比关系，并且sHLA-G与妊娠率有关。

但是，sHLA-G与形态学并无直接的相关性，因此sHLA-G是否能够作为预测胚胎发育潜能的指标还有待研究考证[30]。

1.5 其他随着研究的不断深入，越来越多的临床及科研指标应用于胚胎发育潜能的预测，胰岛素样生长因子、白血病抑制因子、ley寡聚糖和血小板激活因子都被认为与胚胎的发育存在关联[31]。

早期研究显示，血小板活性因子（PAF）在生殖中有重要作用，PAF可以调节胚胎的发育能力，促进细胞分裂和囊胚的形成[32]。

Mains等[33]选取优质胚胎培养液和非优胚胎培养液各30例，使用双向凝胶电泳法检测其中的载脂蛋白A1，检测结果显示形态学分级较高的囊胚培养液中，载脂蛋白A1的含量较高，提示载脂蛋白A1在胚胎的早期发育中起到一定的作用，可考虑将其作为胚胎选择的标记物。

研究者们通过对卵泡液中的相关激素与IVF-ET 妊娠结局关系的研究时发现，抵抗素、瘦素和胰岛素与IVF-ET后胚胎的存活率有关[34]。

2 代谢组学和预测模型
代谢组学研究主要涉及三个方面：目标代谢物模型、非目标代谢物模型和新陈代谢指纹。

目标代谢物模型分析是通过其化学结构测量预先确定的代谢物，相反，非目标代谢物模型是针对所有光谱峰中没有关联的某些化合物化学结构的测定。

新陈代谢指纹是考虑整体代谢的一种模式，可用于样本分类。

目标代谢物模型分析相对简单，因为对应于特定化合物的光谱区域已经被确定，目前主要是对这些区域进行分析。

然而，非目标代谢物模型分析和新陈代谢指纹需要提供高效的生物信息和对高维复杂的代谢组学数据进行准确分析[35]。

代谢组学数据是高维小样本数据，一方面，增加样本的数量就会提高分析的质量，但是生物样本通常是有限的，特别是在人类为受试者的情况下。

另一方面，通过使用降维的方法，如主成分分析等可以消除冗余的数据，并降低计算分析的成本[36]。

在数据分析中一个关键步骤是归一化预处理，进行标准化预处理后，数据可以使用范围广泛的统计学分析方法来预测模型，也可以通过计算机来预测个体胚胎植入潜力。

预测模型这个过程中，要将原始数据以一个结构化和公正的方式分割成训练组和测试组，其中模型的构建和预测性能的评估需要双盲测试样本。

对该模型的性能进行评估时，考虑到预测的敏感性和特异性，最好采用ROC曲线。

建立一个这样的模型是至关重要的，因为它可以处理资料来源的偏倚，确保预测的可靠性和一致性。

当前，最常见的偏倚主要来源研究人口的规模、模型选择、测试阶段和绩效评估等。

通过代谢组学选择胚胎预测模型，要确保其在不同中心的稳定性，一旦预测模型的稳定性得到保证，它就可以被用来作为一种工具或与其他可用标准在临床实践中结合使用。

3 展望
目前，随着相关研究的不断深入及研究技术的不断革新，对于评价人类胚胎的发育潜能取得了一定的进展。

代谢组学作为一种辅助生殖领域中的新兴研究技术，逐渐凸显了其临床优
势，但仍具有局限性。

临床中仍迫切需要一种快速、直观、无损、全面的评价方法，这将是辅助生殖领域中的一个较为关键的问题，也将是广大学者今后研究的方向之一。

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（收稿日期：2016-10-25）（本文编辑：程旭然）。